一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型CRISPR Cas13a‑gRNA表达载体及其应用。CRISPR Cas13a‑gRNA表达载体由NF‑κB特异性启动子DMP和U6启动子分别控制Cas13a和gRNA的表达形成；Cas13a‑gRNA表达载体的gRNA 5′端为可靶向特定基因mRNA的28nt序列，其产生的gRNA可引导Cas13a蛋白结合并切割特定基因的mRNA，造成特定基因表达抑制。本发明专利技术构建了的新型CRISPR Cas13a‑gRNA表达载体可特异性敲低促癌基因在癌细胞中的表达，进而导致癌细胞生长抑制和凋亡，但不影响正常细胞的靶基因表达及生长；本发明专利技术的表达载体可应用在制备新型癌症基因治疗试剂中。

A new CRISPR cas13a gRNA expression vector and its application

【技术实现步骤摘要】
一种新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体及其应用
本专利技术涉及癌症基因治疗生物
，具体涉及新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体及其在癌细胞生长抑制中的应用。
技术介绍
癌症是困扰人类健康和威胁人类生命的重要疾病。在于癌症的长期斗争中，人类已经发展了手术、化疗、靶向治疗、免疫治疗等多种癌症治疗手段，也取得了显著的进步，癌症生存率显著提高。但目前癌症治疗的水平，仍然于广大患者对健康和生命的期望存在很大的距离。因此，积极发展新型癌症治疗技术仍是医学领域的持续努力的目标。基因治疗是未来医学的前沿领域和技术高地，基因治疗在遗传病治疗领域取得的进展已经受到医学界的瞩目，但该技术用于癌症治疗尚没有显著突破。因此，探索癌症单基因治疗技术也发展新型癌症治疗技术的主要突破口。癌症基因治疗，顾名思义，就是通过向癌细胞内导入遗传物质，通过遗传物质发挥治疗作用，干扰癌细胞生长或杀灭癌细胞。特别是向细胞中导入某种基因，通过表达基因产物如干扰RNA或蛋白，引发癌细胞生长抑制或凋亡、坏死。基因治疗中两个问题至关重要，一是基因的选择，直接决定治疗效率；二是控制基因只在癌细胞中表达，即癌细胞特异性。相对而言，基因的选择问题不大，基于目前基因组科学对大量基因功能的研究，不少基因特别是编码干扰RNA及其抑癌蛋白的基因，导入细胞后其表达产物都会或多或少产生对癌细胞的抑制作用。最关键的是如何控制基因只在癌细胞中表达，即癌细胞特异性。目前基于合成生物学原理，已经发展了一些基因开关，用于控制基因在癌细胞中的特异性表达，但这些基因控制元件构成复杂、效率较低，与应用还有较大的距离。在申请人过去的研究中，申请人基于对重要炎症及癌症相关转录因子NF-κB的大量研究，构建了一种NF-κB特异性启动子，该启动子由NF-κB诱骗(Decoy)序列与最小启动子(MinimalPromoter)连接而成，被称为DMP启动子(专利申请号CN201710812983.2)(IntJBiochemCellBiol.2018,95:43–52；ControltheintracellularNF-κBactivitybyasensorconsistingofmiRNAanddecoy)。因此，该启动子的转录激活活性主要取决于细胞中的NF-κB活性。由于NF-κB在各种癌症中都被过度激活，因此证明了该启动子可以在多种癌细胞中特异性地驱动效应基因的表达，而在正常细胞中不表达(专利申请号CN201711335257.2、CN201810163823.4)(HumGeneTher.2019,30:471-484；ACell-SpecificNuclearFactor-KappaB-ActivatingGeneExpressionStrategyforDeliveringCancerImmunotherapy)。因此，DMP启动子是一种癌细胞特性启动子，其能控制其下游基因只在癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达。该启动子在未来癌症基因治疗领域具有广泛而重要的应用价值。由于微生物群落中的生存竞争，已经产生了多种抗病毒防御策略。在这些防御机制中，几乎所有古细菌都拥有成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)相关基因(Cas)适应性免疫途径，并且大约有一半的细菌使用CRISPRRNA(crRNA)引导的核酸酶保护微生物免受病毒和其他外来核酸的侵害。CRISPR/Cas系统分为两大类：I类，通过多效应物复合物介导干扰；II类，使用单、多域效应子介导干扰。根据CRISPR阵列和特征干扰效应物的基因组结构，这两个类别进一步细分为6种类型和33种亚型。I类包括I，III和IV类型，II类包括II，V和VI类型。与其他Cas核酸酶不同，VI-ACRISPR/Cas系统的特征蛋白Cas13a(之前称为C2c2)具有其他已知Cas蛋白所不具有的独特功能，其中包含高级真核生物和原核生物两个核苷酸结合域(HEPN)，具有催化crRNA成熟和ssRNA降解两个单独的核糖核酸酶活性，使Cas13a可以作为单组分可编程的RNA引导的RNA靶向CRISPR效应子。CRISPR/Cas13a系统已经被用作具有渺摩尔(attomolar)灵敏度和单碱基错配特异性的快速DNA或RNA检测技术，被称为“特异性高灵敏酶报告物解锁”(SpecificHighSensitivityEnzymaticReporterUnLOCKing，SHERLOCK)。这种体外应用依赖于Cas13a的侧向效应(collateraleffect)和等温扩增相结合。Cas13a的侧向效应是指激活的Cas13a在识别其靶RNA后，参与附近非靶标荧光报告分子RNA的“侧向”切割。然而，Cas13a在细胞中没有类似的侧向作用，但仍保持其对靶RNA的高特异性切割活性。有研究表明，LwaCas13a可以在哺乳动物和植物细胞中异源表达，并可被引导RNA(guideRNA，gRNA)引导，有效敲低(knockdown)报告基因或内源基因转录本(transcripts)。目前仍然无法做到人工控制Cas13a-gRNA仅在癌细胞中表达，该系统还没有报道被用于特异性敲低癌细胞中的促癌基因表达。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有CRISPRCas13a-gRNA表达载体存在的问题，本专利技术提出一种新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体，运用该载体可制备靶向特定基因的Cas13a-gRNA表达载体，用于特异性敲低特定基因在癌细胞中的表达，以此抑制癌细胞的生长。本专利技术还提供了一种基于新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体的应用。本专利技术提出的新型CRISPRCas13a-gRNA有潜力用于制备新型癌症基因治疗试剂。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体，由DMP启动子和U6启动子分别控制Cas13a和gRNA的表达，构建新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体。其中，所述DMP启动子是一种NF-κB特异性启动子，由NF-κB诱骗子和最小启动子连接形成(专利申请号CN201710812983.2)，该启动子可激活其下游基因在各种癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达(专利申请号CN201711335257.2、CN201810163823.4)；所述DMP启动子可激活Cas13a基因在癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达。其中，所述U6启动子为一种真核细胞RNA聚合酶III识别启动子，可激活gRNA在真核细胞中的表达；所述gRNA的5′端为靶向特定基因mRNA的28nt序列，gRNA为可与Cas13a结合的一种RNA。作为优选，所述CRISPRCas13a-gRNA表达载体的功能元件为DMP-Cas13a-U6-gRNA；所述这些功能元件及其DNA序列如说明书图1所示。作为优选，所述CRISPRCas13a-gRNA表达载体的功能元件DMP-Cas13a-U6-gRNA的DNA序列如SEQIDNO.1所示。其中，所述新型CRI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体，其特征在于，由DMP启动子和U6启动子分别控制Cas13a和gRNA的表达，构建新型CRISPR Cas13a-gRNA表达载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体，其特征在于，由DMP启动子和U6启动子分别控制Cas13a和gRNA的表达，构建新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体。


2.根据权利要求1所述的新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述DMP启动子是一种NF-κB特异性启动子，由NF-κB诱骗子和最小启动子连接形成，该启动子可激活其下游基因在各种癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达；所述DMP启动子可激活Cas13a基因在癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达。


3.根据权利要求1所述的新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述U6启动子为一种真核细胞RNA聚合酶III识别启动子，可激活gRNA在真核细胞中的表达。


4.根据权利要求1-3任一所述的新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述表达载体的功能元件为DMP-Cas13a-U6-gRNA；所述功能元件DMP-Cas13a-U6-gRNA的序列如SEQIDNO.1所示。


5.根据权利要求1-3任一所述的新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述CRISPRCas13a-gRNA表达载体其表达产物为Cas13a蛋白和gRNA；所述gRNA的5′端为靶向特定基因mRNA的28nt序列；所述Cas13a蛋白和gRNA可形成Cas13a-gRNA复合物，该复合物中的Cas13a蛋白在gRNA的引导下可靶向结合并切割特定基因的mRNA，造成其表达抑制。


6.根据权利要求5所述的新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述特定基因可以是任何编码RNA、多肽或蛋白的基因，其编码产物可促进癌细胞生长、转移或耐药；所述特定基因其表达经Cas13a-gRNA复合物抑制后，可引发癌细胞生长、转移或耐药的抑制。


7.根据权利要求5所述的新型CRISPRCas13a-gRNA表达载体，其特征在于，所述特定基因为促癌相关基因。


8.根据权利要求5所述的新型...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，高金良，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32