合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法。以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌为合成底盘，将海藻糖合成酶基因构成表面展示基因表达盒并转化能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母，构成重组解脂耶氏酵母菌。然后以该重组酵母菌先发酵葡萄糖生成赤藓糖醇，分离酵母细胞用作全细胞催化剂一步转化麦芽糖生成海藻糖。转化结束后在转化液中加入氮源和无机盐，接种酿酒酵母分解转化液中的杂质得到高纯度海藻糖。由于该方法采用酵母全细胞转化，相对于破细胞纯化酶等工艺，不但减少了步骤，而且无酶制备成本。

【技术实现步骤摘要】
合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法
本专利技术属于食品生物
，涉及一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法；具体是利用解脂耶氏酵母表面展示海藻糖合成酶一步转化麦芽糖合成海藻糖的方法。
技术介绍
海藻糖(Trehalose)由两分子α-葡萄糖通过α-1，1糖苷键连接，属于非还原性二糖(non-reducingdisaccharide)，最早在十九世纪早期从黑麦麦角中发现的，后来在各种动植物，微生物细胞中均发现海藻糖的存在，尤其是在低含水量或者脱水的细胞中含量丰富。比如，在干燥的复活草(如鳞片卷柏Selaginellalepidophylla)、休眠的线虫(nematodes)、脱水面包酵母(baker’syeast)、干燥的地衣植物中含量丰富(Elbeinetal.Newinsightsontrehalose:amultifunctionalmolecule.Glycobiology,13:17-27)，这些生物细胞中失去99％的水分仍能生存若干年，而当有水存在时能迅速恢复细胞活力。在脱水面包酵母中，海藻糖的含量占据细胞干重的10～15％左右。海藻糖在细胞中的存在，除了作为能源储存外，更多的作为抵御外界不良环境的保护剂(protectant)，使得细胞中的大分子(如酶)在极端条件下(如高温、低pH、干燥、冷冻等)仍然具有活性，能维持细胞质中大分子的结构以及维持细胞膜的完整性(OhtaniandUsui.1994.Productionoftrehalosebyfermentationanditsapplication.FoodChem,2:91-95；SingerandNas-Lindquist.1998.Multipleeffectsoftrehaloseonproteinfoldinginvitroandinvivo.MolCell,1:639-648)。由于没有还原基团，海藻糖与富含氨基酸的食品配料混合后在高温下不会发生美拉德反应，能良好的保持食品的风味。海藻糖还具有良好的持水性，能与失水细胞中残余的水牢固结合保护生物大分子的结构完整性(BeltonandGil.1994.IRandRamanspectroscopicsstudiesoftheinteractionoftrehalosewithheneggwhitelysozyme.Biopolymers,34:957-961)。由于海藻糖具有上述优良的生理生化特性，其在医药领域、食品领域以及化妆品领域都得到十分广泛的应用。在医药领域常用于疫苗、血液制品、抗体的稳定剂，使疫苗在常温下以及冷冻的条件下同样具有稳定性，增加血液制品以及抗体在冷冻条件下的稳定性(PatentWO1996/022107)。海藻糖还可以和透明质酸配伍用于制备眼部用药传递系统以及润滑剂(中国专利技术专利200410036422.0，200410075549.3)，还可以制成关节腔内注射药剂，起到抗氧化和抗自由基的作用，改善炎症症状，为软骨修复提供所需要的糖分，加速软骨的修复(中国专利技术专利200610103472.5)。同时海藻糖还可以进行衍生化合成其它的药物，在防止肿瘤的侵袭以及转移具有显著的效果(中国专利技术专利201010246792.2，201110150999.4)。海藻糖的衍生物还可以用于制备皮肤外用剂，具有促进血液循环，保湿，吸收紫外线以及抗氧化的功效(PatentWO2004/071472,JP2004/001401)。海藻糖由于具有低甜度、非还原性、抗干燥等作用，在食品领域有着广阔的应用前景。海藻糖的甜度相当于蔗糖的45％，口感柔和，能在小肠内被消化吸收，可作营养源。此外还具有抗腐蚀性，不生成引起龋齿的不溶性葡聚糖，不被口腔病原菌所利用，因此可以作为新型甜味剂，添加于奶粉、口香糖、巧克力、冰淇淋、糖果等食品中。由于海藻糖对酸、热都非常稳定，不具有还原性，在食品加工过程中不会产生美拉德反应，因此在食品加工过程中添加一定量德海藻糖，对于淀粉类食品可抑制淀粉的老化，延长食品的保质期；可抑制蛋白质的变性；对于肉类、油炸类等含脂肪多的食品。添加海藻糖可有效的抑制脂肪酸化，保持食品原有风味。海藻糖由于具有优良的保湿性使其成为化妆品原料之一。用于皮肤化妆品如洗面奶中，可抑制皮肤干燥；用于唇膏、口腔清凉剂、口腔芳香剂中，可作为甜味剂、呈味改良剂及品质改良剂。无水海藻糖可用于护肤霜等中，作为磷脂及酶的脱水剂。由于海藻糖在医药、食品、化妆品领域均具有十分重要的功效，而且新的功效正在不断的被开发应用，因此，如何更加经济的规模化制备就具有十分重要的价值。最开始的海藻糖制备方法是从酿酒酵母细胞中提取得到(巴西专利技术专利Patent9303490,，日本专利技术专利JP7000190,JP7099988)。由于提取得率低，需要破细胞壁，步骤多，难以实际规模化制备。后来研究发现有些微生物含有海藻糖合成酶能够直接利用麦芽糖发生分子内重排合成海藻糖，此方法转化步骤少，将麦芽糖转化为海藻糖，所需能量较低、分离较为简便，适合规模化生产海藻糖。基于这种单酶体系转化麦芽糖合成海藻糖的原理，国内外许多学者申请了合成海藻糖的专利技术专利。中国专利技术专利(申请号201310112536.8，一种利用全细胞催化合成海藻糖的方法)描述了在大肠杆菌中表达海藻糖合成酶基因，并用经过表面活性剂渗透处理的全细胞转化麦芽糖合成海藻糖。该方法步骤与使用的试剂较多，比如需要采用抗生素筛选，使用诱导剂诱导，使用表面活性剂进行处理细胞，转化率也较低。这些限制条件使得该方法难以规模化采用。中国专利技术专利(申请号201310182033.8，一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法)描述了一种采用来自恶臭假单胞菌、热带假丝酵母、玫瑰链霉菌或大肠杆菌的海藻糖合成酶，并将该酶固定来转化麦芽糖合成海藻糖。该方法同样存在步骤繁多的缺点(培养细胞，破壁，纯化酶，固定化酶等)。另外，采用麦芽糖为底物转化合成海藻糖，由于麦芽糖与海藻糖均属于二糖，反应液中存在较多的未反应完的麦芽糖(一般仍有20％以上的麦芽糖残留)，存在难以将二者分离或者分离困难。目前工业化生产海藻糖主要是以酶转化法，采用大肠杆菌进行酶表达。表达的过程较为复杂，需要使用抗生素(如卡那霉素或者氨苄青霉素等)保持筛选压力，还需要使用诱导剂(如IPTG等)，另外还需要破壁大肠杆菌以释放海藻糖合成酶，在破壁的同时大肠杆菌的内毒素等有害物质也释放出来，同时大肠杆菌是致病微生物，不适合用于食品制备。虽然从大肠杆菌中可以纯化得到海藻糖合成酶，然后以纯酶进行转化麦芽糖合成海藻糖，也可以进行，但是纯化得到纯酶的成本太高。因此，研究开发一种能够将麦芽糖高效转化为海藻糖的新的合成途径对于提高生产效率，降低生产成本具有十分重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有的酶合成或细胞合成海藻糖的不足之处，提供一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，实现由麦芽糖生物合成高纯度海藻糖。本专利技术通过遗传工程将解脂耶氏酵母进行改良，使得该酵母能够合成海藻糖合成酶(Tr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于，以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母作为海藻糖合成酶表达宿主，将海藻糖合成酶表面展示在该菌株表面获得重组菌株。/n

【技术特征摘要】
1.一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于，以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母作为海藻糖合成酶表达宿主，将海藻糖合成酶表面展示在该菌株表面获得重组菌株。


2.如权利要求1所述的合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
S1、设计海藻糖合成酶基因表面展示表达盒，并合成该基因表达盒；
S2、将合成的海藻糖基因表面展示表达盒转化能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母；
S3、筛选含有海藻糖基因表面展示表达盒的重组解脂耶氏酵母。


3.如权利要求2所述的合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于，所述海藻糖合成酶基因表面展示表达盒为含TreS编码序列的表达盒，包含同源臂DNA序列、启动子DNA序列、TreS基因编码序列、终止子DNA序列。


4.一种利用如权利要求1所述的方法构建得到的重组解脂耶氏酵母菌在合成海藻糖中的用途。


5.一种利用如权利要求1所述的方法构建得到的重组解脂耶氏酵母菌合成海藻糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A1、将重组解脂耶氏酵母菌发酵葡萄糖合成赤藓糖醇；
A2、发酵结束后菌液分离得到含赤藓糖醇的发酵液以及酵母菌细胞；
A3、以该酵母菌细胞作为全细胞催化剂，转...

【专利技术属性】
技术研发人员：程海荣，邹亚文，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31