一组来源于植物的胞嘧啶脱氨酶和其在碱基编辑系统中的应用技术方案

本发明专利技术公开了一组来源于植物的胞嘧啶脱氨酶和其在碱基编辑系统的方法及应用。实验证明，植物来源的胞嘧啶脱氨酶可以成功的对受体基因进行碱基编辑，对于基因编辑在植物中的应用具有重要的价值。用具有重要的价值。

【技术实现步骤摘要】
一组来源于植物的胞嘧啶脱氨酶和其在碱基编辑系统中的应用


[0001]本专利技术属于基因的应用
，具体涉及在生物
中，在碱基编辑系统中用来源于植物的胞嘧啶脱氨酶替代非植物源的胞嘧啶脱氨酶，对植物进行的基因编辑的应用。
[0002]
技术介绍

[0003]基因编辑技术作为近年来飞速发展的生物技术之一，被广泛用于动物，植物和微生物中，针对该技术原理的探索或者应用的扩展也在积极的开展中。基因编辑技术就是通过对细胞基因组中目的基因的一段核苷酸序列甚至是单个核苷酸进行替换，切除，增加或者是插入外源的DNA序列，使之产生可遗传的改变。[1]-ꢀ
[3] 虽然各种基因编辑技术的原理及作用方式并不相同，但它们的共同之处是基因编辑都建立在使目标基因DNA产生双链断裂（Double Strand Breaking，DSB）的基础上。因为DNA分子单链断裂或缺失后容易被细胞内的各种修复机制所修复而不产生任何改变 [4] ，但DNA双链断裂的结果则有很大的不同。细胞内DNA双链断裂的修复有两种方式，即同源重组修复(Homologous Recombination, HR)和非同源末端链接修复(Non-Homologous End Join, NHEJ) 。[5]ꢀ-
[7]对于这两种修复方式，同源重组的效率很低，而非同源末端链接修复会造成基因的功能的缺失或者影响基因的正常功能。与此同时，人类的遗传疾病或者植物的一些缺陷是由碱基突变引起的，所以开发出精确的编辑工具对碱基突变的修复有着重要的应用价值。从2016年到2017年，哈佛大学的David R Liu研究团队主要开发了两种碱基基因编辑工具（BE系统）。第一种工具可以将C-G碱基对转变成T-A碱基对，第一代的单碱基编辑工具在发表的文章中称为BE1（Cytidine Base Editing），之后在提高编辑效率，扩大BE可以编辑的基因组位点方面又有持续的研究发展，BE的后续版本分别称为BE1，BE2和BE3；第二种工具可以将A-T碱基对转变成为G-C碱基对，称为ABE（Adenine Base Editing）。
[0004]BE系统实现C->T碱基替换的原理是通过胞嘧啶脱氨酶可以直接实现对单个胞嘧啶（Cytosine，C）碱基的编辑，突变为胸腺嘧啶（Thymine，T），其中尿嘧啶糖苷酶抑制剂（Uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI）可以提高突变效率。具体的替换过程为是gRNA引导Cas9与胞嘧啶脱氨酶的融合蛋白结合在目标DNA上，产生单链断裂，胞嘧啶脱氨酶会将靶点上的C脱氨变成U，尿嘧啶糖苷酶抑制剂（uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI）能够抑制尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil DNA glycosylase, UDG）清除DNA中的U，之后U：G配对将其更多的修复为U：A，通过DNA的复制，U：A实现T：A配对，从而实现C到T的精确替换。在此过程中胞嘧啶脱氨酶是实现碱基替换的关键，在David Liu开发的各个BE版本中，胞嘧啶脱氨酶始终用的是来源于小鼠的胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC1），其他的研究人员也在持续优化改良碱基基因编辑工具，而后期陆续发现的也可用在碱基编辑工具中的胞嘧啶脱氨酶有PmCDA1/APOBEC3A等，但是它们都来源于动物或者微生物。[8] [9] 至今尚未发现一个来源
于植物的胞嘧啶脱氨酶可以成功的用于碱基基因编辑。
[0005]在对植物进行基因编辑的研发过程中，寻找一个从植物来源并可以用于碱基基因编辑的胞嘧啶脱氨酶基因就尤为重要。关于植物中的胞嘧啶脱氨酶的研究有很多，但是从未有研究植物来源的胞嘧啶脱氨酶在基因编辑技术中的应用，国内外也未有任何关于植物来源的胞嘧啶脱氨酶在基因编辑技术中应用的报导。而在对胞嘧啶脱氨酶（APOBEC）家族中的研究发现，APOBEC家族中的每个蛋白的功能十分的多样化，虽然可能在蛋白质结构上可以将这些蛋白归于一类，但是对于每种APOBEC蛋白来说，其功能和组织特异性表达都有着很大的差异。 [10] [11] 本专利技术的意义在于找到了来自于植物源的胞嘧啶脱氨酶，并且在碱基基因编辑的系统中对水稻成功的实现了碱基C到T的替换。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一个或者多个可用于碱基基因编辑的来源于植物的胞嘧啶脱氨酶的基因序列。在碱基编辑过程中，使用上述序列之一，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生C到T的替换。
[0007]本专利技术的一个目的在于提供与基因序列表序列1到序列46中的任一的基因的不低于90%的基因相似性的基因，其来源于植物，包括但不限于拟南芥，水稻，大豆，玉米，木薯，亚麻，大叶杨，苜蓿，菜豆，苹果，棉花，高粱，花生，马铃薯，黄瓜，番茄等等。在碱基编辑过程中，使用上述序列之一，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生C到T的替换。
[0008]本专利技术的另一个目的在于提供一个或者多个的基因序列，上述基因序列选自基因序列表中序列1到序列46, 上述基因都来自于植物，其来源分别为拟南芥，水稻，大豆，玉米，木薯，亚麻，大叶杨，苜蓿，菜豆，苹果，棉花，高粱，花生，马铃薯，黄瓜，番茄。在碱基编辑过程中，使用上述序列之一，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生C到T的替换。
[0009]本专利技术的另一个目的在于提供一种可用于植物的碱基基因编辑的方法，具体可为方法G1，采用该方法，在不引入非植物源的胞嘧啶脱氨酶的情况下，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生C到T的转变。具体的步骤包括：在受体中表达sgRNA，Cas9蛋白和植物来源的胞嘧啶脱氨酶，从而所述受体基因中的目标核苷酸的碱基进行编辑，发生从C到T的替换。
[0010]本专利技术的另一个目的在于提供一种用于植物的碱基基因编辑的方法，具体可为方法G2，采用该方法，在不引入非植物源的胞嘧啶脱氨酶的情况下，可以对目标核苷酸的碱基进行编辑，使其发生C到T的转变。具体的步骤包括：在受体中表达sgRNA，Cas9蛋白，植物来源的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂，从而所述受体基因中的目标核苷酸的碱基进行编辑，发生从C到T的替换。
[0011]所述方法G1中，“在受体中表达sgRNA，Cas9蛋白和植物来源的胞嘧啶脱氨酶”可通过将所述sgRNA的编码基因，Cas9蛋白的编码基因和所述的植物来源的胞嘧啶脱氨酶的编码基因导入受体实现。具体的，可以放在一个载体中导入受体，也可以放在不同载体中分别导入受体。
[0012]所述方法G2中，“在受体中表达sgRNA，Cas9蛋白，植物来源的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂”可通过将所述sgRNA的编码基因，Cas9蛋白的编码基因，所述的植物来源的胞嘧啶脱氨酶的编码基因和尿嘧啶糖苷酶抑制剂的编码基因导入受体实现。具体的，可
以放在一个载体中导入受体，也可以放在不同载体中分别导入受体。
[0013]上述任一所述的方法中，还可在受体中表达抗潮霉素蛋白（用于筛选）。所述“在受体中表达抗潮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一个可用于碱基编辑的来源于植物的胞嘧啶脱氨酶，其基因序列与SEQ ID NO：1
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46的任一基因序列的相似性不小于90%。2.一个可用于碱基编辑的来源于植物的胞嘧啶脱氨酶，其基因序列为SEQ ID NO：1
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46的任一基因序列。3.一个可用于碱基编辑的来源于水稻的胞嘧啶脱氨酶，基因序列为SEQ ID NO：2。4.一个可用于碱基编辑的来源于拟南芥的胞嘧啶脱氨酶，基因序列为SEQ ID NO： 1。5.一种可用于植物的碱基编辑方法，为方法G1或方法G2：所述方法G1包括如下步骤：在受体中表达sgRNA, Cas9蛋白，权利要求1，2，3或者4中所述的来源于植物的胞嘧啶脱氨酶，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑；所述方法G2包括如下步骤：在受体中表达sgRNA, Cas9蛋白，权利要求1，2，3或者4中所述的来源于植物的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂，从而对所述受体基因组中的靶基因进行碱基编辑。6.如权利要求5中所述的方法，其特征在于：所述方法G1中，“在受体中表达sgRNA, Cas9蛋白和权利要求1，2，3或者4中所述的来源于植物的胞嘧啶脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蕾，李相敢，侯丽敏，祁幼林，王身昌，黎跃进，
申请(专利权)人：科稷达隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：