一组抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一组抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用。提供了使植物具有除草剂抗性的ACCase蛋白质，其与野生型相比，带有在位点2008从A到V的氨基酸突变。另外，本发明专利技术还提供了相应的获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用、以及鉴定本发明专利技术的抗除草剂植物或抗除草剂植物的方法。

【技术实现步骤摘要】
一组抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用
本专利技术属于植物蛋白质领域，具体而言，本专利技术涉及能赋予高粱或者其他植物除草剂抗性(耐受性)的蛋白及其在植物育种中的应用。
技术介绍
除草剂又称杀草剂。能杀死杂草或有害植物，而不影响农作物正常生长的化学药剂。可用于防治农田杂草或杀灭非农耕地的杂草或灌木。按其作用特点可分为选择性除草剂和灭生性除草剂。选择性除草剂指在使用一定剂量和浓度的范围内，可有选择性地杀死某些种类的植物，而对其他种类植物无害。然而，由于灭生性除草剂通常也能杀死农作物本身，因此对一般不具有除草剂抗性(耐受性)的农作物而言，除草剂的使用在时间和空间上受到了极大限制，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂，以达到除草的目的。传统的清除杂草方式是人工操作，所需要消耗的人力资源和成本非常高，不利于农业大规模的生产。培育对除草剂有抗性的农作物有极大的经济价值和商业用途，这样可以在种植期间使用除草剂，对抗性农作物使用对应的除草剂，在不影响农作物生长的情况下，杀死杂草，不但拓宽除草剂的使用范围，也可以节约农业的人力资源和成本，有利于农业的大规模的生产。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase,ACCase)，是植物中脂肪酸合成途径中的关键酶之一。通过抑制ACCase即可抑制植物脂肪酸合成，最终造成植株死亡达到杀死植物的目的。因此，农药公司以ACCase为靶标，开发研制了一系列的除草剂。在市场上的这些除草剂可大致分为三类，即芳氧苯氧丙酸酯类、环己二酮类和苯基吡唑啉类。(王俊丽,徐小博,孙玥,朱晔荣,王勇,刘学军.乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂的研究进展ResearchProgressonAcetyl-CoACarboxylaseInhibitorHerbicides[J].植物学研究,2019,08(05):410-415.)因此，在本文中，除草剂抗性指的是对上述三大类的除草剂具有耐受性。而植物对这类除草剂的抗性则来自ACCase基因一个或多个氨基酸突变而导致酶的结构变化。本专利技术人正是长期而艰苦的研究实践，通过化学诱变的方法在高粱突变植株中发现了一系列(突变)蛋白，其能够在除草剂存在的条件下基本保持原有蛋白的正常植物生理功能，从而使得植物具有除草剂抗性(耐受性)。本专利技术人还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因，基因编辑或者非转基因，非基因编辑植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，如其他农业植物等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个或者多个新的使植物具有除草剂抗性的氨基酸序列，本领域人员可通过已知的生物技术，例如转基因，基因编辑或者突变技术，使得植物能够表达上述的蛋白质，该植物既可具有除草剂的抗性。具体而言，在所述目的方面，本专利技术提供了使植物具有除草剂抗性的ACCase的氨基酸序列。ACCase就是乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase,ACCase)的简称,其酶分类编号为EC6.4.1.2。使植物具有除草剂抗性的ACCase的氨基酸序列与野生型相比，其在位点2008上，带有从A到V的氨基酸突变。野生型高粱的ACCase的氨基酸基因序列如SEQIDNO：2所述，突变后的ACCase的氨基酸序列如SEQIDNO：4所述。本专利技术的另一个目的在于提供具有除草剂抗性的x1)植物；x2)单子叶植物或双子叶植物；x3)高粱。示例性的植物包括水稻、玉米、小麦、黑麦、燕麦、大麦、大豆、马铃薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西红柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、烟草、或拟南芥等。本专利技术的另一个目的在于提供获得具有除草剂抗性的x1)植物；x2)单子叶植物或双子叶植物；x3)高粱的方法。示例性的植物包括水稻、玉米、小麦、黑麦、燕麦、大麦、大豆、马铃薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西红柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、烟草、或拟南芥等。上述除草剂抗性植物的获得的方法是通过生物技术，例如转基因，基因编辑，或者突变技术，例如化学诱变等或者通过传统育种，例如将已有除草剂抗性植物与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代等等的方法，将上述氨基酸突变在植物中表达，从而使植物获得除草剂的抗性。本专利技术的另一个目的在于提供上述基因在x1)或x2)或x3)中获得除草剂抗性的应用:x1)植物；x2)单子叶植物或双子叶植物；x3)高粱。示例性的植物包括水稻、玉米、小麦、黑麦、燕麦、大麦、大豆、马铃薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西红柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、烟草、或拟南芥等。该应用包括，通过生物技术，突变技术或者传统育种技术获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，例如转基因植物中的应用，基因编辑植物中的应用或者非转基因植物，非基因编辑植物中的应用等等。本专利技术的另一个目的在于提供一个鉴定方法，本领域人员可通过已知的生物技术，通过检测是否在植物中是否含有上述的突变后的氨基酸序列，来判断植物是否采用本专利技术方法获得的植物的鉴定方法。测定的步骤可以通过常规的核酸检测和/或蛋白质检测方法来进行，只需要能够检测出蛋白质带有A2008V突变或其相应核酸突变的方法都可以。下面将通过具体的附图和实施例对本专利技术进行详细地描述，使本专利技术更容易理解。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本专利技术范围的限制。而在阅读本说明书之后，在不脱离本专利技术的目的和/或所附的权利要求书的范围的前提下，本领域技术人员可以提出本专利技术的其它实施方式，修改和等同物。依据本说明书的论述，本专利技术的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的了。附图说明图1：含有A2008V突变体植株与野生型植株在喷洒除草剂后的14天在大田里的对比照片；图2：含有A2008V突变体植株与野生型植株在喷洒除草剂后的12天在温室里的对比照片。具体实施方式下述实施例子中所用方法如无特殊说明，均为本领域人员常用的方法。实施例1：从高粱EMS诱变库M2代群体中筛选抗性植株为了对高粱突变体库进行大规模筛选，我们通过化学诱变的方法构建高粱突变体库。具体步骤如下：称取大约1kg的高粱种子，装入80目的网袋中，共计10份，自来水冲洗2次。然后用0.3％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS)浸泡高粱种子12h，期间每1h摇动一次种子。12h后取出种子，置于自来水中浸洗5次，EMS废液及浸洗废液收集起来专门容器保存。将浸洗后的种子摊开风干，之后即刻安排播种。同时，光照培养箱测试处理后的种子芽率，控制发芽率在65％左右。待植株成熟后分地块收获，每个地块面积1亩。地块内分大中小穗3种类型，分别混收，晾干至含水量13％。将收获的种子按1万粒/m2的密度播种，待幼苗长至3～4叶期时，用芳氧苯氧丙酸酯类除草剂“喹禾糠酯”(CAS号119738-06-6)喷雾处理，4％水剂，喷施剂量160ml/亩、兑水30L。2周后调查幼苗枯死情况，发现其中有绿色存活小苗，保留并繁殖这些绿色小苗。实施例2：筛选出的抗除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组抗除草剂植物的ACCase的突变体的氨基酸序列，与其野生型相比，带有A2008V的突变。/n

【技术特征摘要】
1.一组抗除草剂植物的ACCase的突变体的氨基酸序列，与其野生型相比，带有A2008V的突变。


2.一组抗除草剂高粱的ACCase的突变体的氨基酸序列，与其野生型相比，带有A2008V的突变。


3.权利要求1或者2所述的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。


4.一组抗除草剂植物的ACCase的突变体的核酸序列，其编码权利要求1或者2所述的氨基酸序列。


5.一组抗除草剂高粱的ACCase的突变体的核酸序列，其编码权利要求1或者2所述的氨基酸序列。


6.权利要求4或5所述的核酸序列如SEQIDNO：3所示。


7.获得具有除草剂抗性的植物的方法，其包括如下步骤：（1）使植物包含权利要求4~6所述的核酸；或，（2）使植物表达权利要求1~3所述的蛋白质。


8.获得具有除草剂抗性的高粱的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪峰，罗祖勇，张李，王明，李莹莹，李相敢，黎跃进，
申请(专利权)人：科稷达隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11