一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法技术

本申请公开了一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌，所述酵母菌的hem14基因不能正常表达。hem14基因功能缺失的酵母菌株KYD‑2在不补充氯高铁血红素的培养基中生长明显被抑制，而在KYD‑2中表达拟南芥PPO1后能够使其恢复生长，并且对乙氧氟草醚敏感。本发明专利技术还提供了该乙氧氟草醚敏感型酵母菌的制备方法及用途。本发明专利技术提供的方法制备的hem14缺陷酵母菌株解决了酵母对乙氧氟草醚不敏感的技术问题，可用于测试和比较具有乙氧氟草醚等PPO抑制剂类除草剂抗性基因的抗性水平。

【技术实现步骤摘要】
一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法
本申请涉及基因工程
，具体而言涉及一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌及其制备方法。
技术介绍
乙氧氟草醚是一种低毒、触杀型的原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogenoxidase，PPO)抑制型除草剂，在有光的情况下发挥其除草活性，分子式为C15H11ClF3NO4。在芽前和芽后早期施用效果最佳，对种子萌发的杂草杀草谱广，能防除阔叶杂草、莎草及稗，但对多年生杂草具有抑制作用。防治对象：可防除移栽稻、大豆、玉米、棉花、花生、甘蔗、葡萄园、果园、蔬菜田和森林苗圃的单子叶和阔叶杂草。酵母(saccharomyce)是基因克隆实验中常用的真核生物受体细胞，是遗传工程和细胞周期研究的模式生物，但是酵母本身对PPO抑制剂类除草剂乙氧氟草醚不敏感，因此难将其应用于筛选耐受乙氧氟草醚(或其他PPO抑制剂类除草剂)的抗性基因。
技术实现思路
在研究中发现将酵母细胞中与植物ppo基因具有相同功能的hem14基因破坏掉后，获得的hem14基因功能缺失的酵母菌株KYD-2在不补充氯高铁血红素的培养基中生长明显被抑制，而在KYD-2中表达拟南芥ppo1后能够使其恢复生长，并且对乙氧氟草醚敏感。因此酵母菌株KYD-2可用于鉴定植物ppo基因或在微生物中与之具备相同功能的基因对乙氧氟草醚(或其他PPO抑制剂类除草剂)的敏感性，用于筛选耐受乙氧氟草醚(或其他PPO抑制剂类除草剂)的抗性基因。本专利技术公开了一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌，所述酵母菌的hem14基因不能正常表达。hem14基因功能缺失的酵母菌株KYD-2在不补充亚铁血红素的的培养基中生长明显被抑制，而在KYD-2中表达拟南芥PPO1后能够使其恢复生长，并且对乙氧氟草醚敏感。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述hem14基因中编码第120个氨基酸的密码子为TAG。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述hem14基因的序列为SEQIDNO:2。该序列中将突变位点的下游相邻的密码子处设计了一个无义突变，使GGTTCC变为GGTACC，该突变后序列是KpnI识别的酶切位点，有利于鉴定检测。本专利技术还提供了上述乙氧氟草醚敏感型酵母菌的制备方法，包括：1)根据SEQIDNO:2设计第一引物和第二引物，并使第一引物或第二引物中包含hem14基因的第358位碱基变异位点,并使所述第358位碱基变异位点由C变为T；2)使用所述第一引物和第二引物扩增获得包含步骤1)所述变异位点的基因片段；3)以步骤2)所述的基因片段构建重组载体；4)将重组载体转化到酵母细胞中，使含有所述变异位点的基因片段通过同源重组或基因剪接的方式整合到hem14基因中。在根据本专利技术的一个实施方案中，当通过基因剪接的方法进行时，重组载体的构建包括：a)以pCAS为模板，SEQIDNO:4和SEQIDNO:5为引物扩增，获得核苷酸序列为SEQIDNO:8的基因片段。b)以pCAS为模板，SEQIDNO:6和SEQIDNO:7为引物扩增，获得核苷酸序列为SEQIDNO:9的基因片段；c)以XmaI/PstI酶切pCAS载体质粒，获得核苷酸序列为SEQIDNO:10的基因片段；d)利用同源重组法将核苷酸序列为SEQIDNO:8的基因片段、核苷酸序列为SEQIDNO:9的基因片段、核苷酸序列为SEQIDNO:10的基因片段融合获得pCAS-hem载体SEQIDNO:11。在根据本专利技术的一个实施方案中，设计供体引物对，并扩增获得供体片段。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述供体引物对为SEQNO12和SEQIDNO:13；所述供体片段的核苷酸序列为SEQIDNO:14。在根据本专利技术的一个实施方案中，将供体片段与pCAS-hem载体转化到酵母细胞中，筛选培养即得。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述筛选培养是在含有G418和氯高铁血红素的YPDA琼脂培养基中进行的。本专利技术另一方面还提供了上述的酵母细胞在筛选耐受PPO抑制剂类除草剂的抗性基因中的应用；优选的，所述PPO抑制剂类除草剂为乙氧氟草醚。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的方法使原本对乙氧氟草醚不敏感的酵母改变了对乙氧氟草醚的敏感性，缺陷型菌株对乙氧氟草醚敏感转而依赖于被导入的表达PPO的基因，如导入原本对乙氧氟草醚敏感的植物ppo基因，则该菌表现为对乙氧氟草醚敏感，同样也可能对其他PPO抑制剂类除草剂表现为敏感型。本专利技术提供的方法制备的hem14缺陷酵母菌株可以测试来目的自植物的ppo基因的功能。以本方法制备的缺陷型酵母菌株为宿主菌，将目的植物的ppo基因导入该宿主菌，在不额外添加氯高铁血红素的YPAD培养基中培养，如观察到培养基中有正常的菌落产生，则表明该来自植物的ppo基因具有表达PPO(原朴啉原氧化酶)的功能。容易推测的是，将其他基因，如细菌中的hemG等导入该宿主菌，如果观察到不额外补充氯高铁血红素的YPAD培养基中有正常菌落产生，则该基因也编码与Hem14功能相似的PPO蛋白。本专利技术提供的方法制备的hem14缺陷酵母菌株可用于筛选具有乙氧氟草醚等PPO抑制剂类除草剂抗性的基因。以本方法制备的缺陷型酵母菌株为宿主菌，将目的植物的突变的ppo基因导入该宿主菌，在含有乙氧氟草醚的YPAD培养基中培养，如观察到培养基中的菌落生长明显优于野生型基因，则表明该来自植物的突变的ppo基因表达的PPO蛋白具有乙氧氟草醚耐受性。容易推测的是，将其他基因，如细菌中的hemG等导入该宿主菌，如果观察到在含有高浓度乙氧氟草醚的YPAD培养基中正常菌落产生，则该基因编码的蛋白也能够耐受乙氧氟草醚或其他PPO抑制剂类除草剂。本专利技术提供的方法制备的hem14缺陷酵母菌株可用于测试和比较具有乙氧氟草醚等PPO抑制剂类除草剂抗性基因的抗性水平。根据本专利技术的实例不难推测，以本方法制备的缺陷型酵母菌株为宿主菌，将目的植物的突变的ppo基因导入该宿主菌，在含有不同浓度乙氧氟草醚的YPAD培养基中培养，可以通过菌落的生长状态来测试和比较不同突变基因耐受乙氧氟草醚的水平。附图说明图1为hem14基因及人工改造变异位点示意图；图2为敲除hem14后的酵母菌KYD-2功能鉴定试验结果图。具体实施方式以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。如无特殊说明，本专利技术中所使用的酵母菌购自淼灵质粒平台，货号S0065(http://www.miaolingbio本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌，其特征在于，所述酵母菌的hem14基因不能正常表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种乙氧氟草醚敏感型酵母菌，其特征在于，所述酵母菌的hem14基因不能正常表达。


2.如权利要求1所述的乙氧氟草醚敏感型酵母菌，其特征在于，所述hem14基因中编码第120个氨基酸的密码子为TAG。


3.如权利要求2所述的乙氧氟草醚敏感型酵母菌，其特征在于，所述hem14基因的序列为SEQIDNO:2。


4.如权利要求1-3中任一项所述的乙氧氟草醚敏感型酵母菌的制备方法，其特征在于，包括：
1)根据SEQIDNO:2设计第一引物和第二引物，并使第一引物或第二引物中包含hem14基因的第358位碱基变异位点,并使所述第358位碱基变异位点由C变为T；
2)使用所述第一引物和第二引物扩增获得包含步骤1)所述变异位点的基因片段；
3)以步骤2)所述的基因片段构建重组载体；
4)将重组载体转化到酵母细胞中，使含有所述变异位点的基因片段通过同源重组或基因剪接的方式整合到hem14基因中。


5.如权利要求4所述的乙氧氟草醚敏感型酵母菌的制备方法，其特征在于，当通过基因剪接的方法进行时，重组载体的构建包括：
a)以pCAS为模板，SEQIDNO:4和SEQIDNO:5为引物扩增，获得核苷酸序列为SEQIDNO:8的基因片段；
b)以pCAS为模板，SEQIDNO:6和SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：董玉凤，周玉姣，李莹莹，闫留华，祁幼林，李相敢，黎跃进，
申请(专利权)人：科稷达隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11