一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用，属于基因工程及微生物发酵技术领域。本发明专利技术提供的基因工程菌出发菌株为酵母菌，所述酵母菌整合了法尼烯合成酶基因AaFS，磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，磷酸转酮酶基因LmPK，乙醛脱氢酶基因DzeutE，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR。发酵生产法尼烯产量达到170mg/L。

【技术实现步骤摘要】
一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用
本专利技术涉及一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用，属于基因工程及微生物发酵

技术介绍
法尼烯(C15H24)是一种倍半萜烯，最早从苹果树中分离得到，在植物防御方面起到重要作用。同时，在能源、医药、食品等领域中，都具有重要的应用前景。在能源方面，法尼烯具有能量密度高、闪点高等特点，可以作为高密度燃料的前体。在医药生产中，法尼烯可以作为生产维生素E侧链(异植物醇)的一个中间体，用于合成维生素E。法尼烯存在于许多植物的精油中，具有青香味，可以用于生产食用香精及香料。此外，β-法尼烯是主要的蚜虫报警外激素，可以用于新型农药的创制。法尼烯的合成可以通过由橙花叔醇(nerolidol)、月桧烯(myrcene)、香叶基溴(geranylbromide)、丁烯醇等中间体，经催化剂催化合成。但该方法存在中间体及催化剂原料缺乏且成本高、操作麻烦、难以放大规模等缺点。而近年来，法尼烯的合成研究主要聚焦于利用微生物以可再生的糖为原料合成法尼烯。目前,以大肠杆菌(Escherichiacoli)为工程菌发酵合成法尼烯的摇瓶产量达到3g/L，7L发酵罐产量达到8g/L(YouS,YinQ,ZhangJ,ZhangC,QiW,GaoL,TaoZ,SuR,HeZ.2017.Utilizationofbiodieselby-productassubstrateforhigh-productionofβ-farneseneviarelativelybalancedmevalonatepathwayinEscherichiacoli.BioresourceTechnology243:228-236.)，其发酵培养基主要含蛋白胨、酵母膏、甘油，并需要添加氨苄青霉素、氯霉素、卡纳霉素以及L-阿拉伯糖、IPTG等昂贵的试剂。以酿酒酵母为工程菌发酵生产法尼烯摇瓶产量可达到1g/L，进而通过扩大发酵在200,000L的工业发酵罐产量达到100g/L，为报道的最大产量(MeadowsAL,HawkinsKM,TsegayeY,AntipovE,KimY,RaetzL,DahlRH,TaiA,Mahatdejkul-MeadowsT,XuL,etal.2016.Rewritingyeastcentralcarbonmetabolismforindustrialisoprenoidproduction.Nature537:694.)，该方法使用以葡萄糖、蔗糖、酵母粉、氨基酸、各种维生素及微量元素等成分构成的培养基为发酵原料生产法尼烯。这些方法往往需要添加昂贵的抗生素、诱导剂及其他试剂，使发酵原料成本过高。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用，采用的技术方案如下：第一，本专利技术的目的在于提供一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌整合了法尼烯合成酶基因AaFS，磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，磷酸转酮酶基因LmPK，乙醛脱氢酶基因DzeutE，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR。所述法尼烯合成酶基因AaFS，GenBank:AY835398.1；磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，GenBank:CP018335.1；磷酸转酮酶基因LmPK，GenBank:AY804190.1；乙醛脱氢酶基因DzeutE，GenBank:CP006929.1；羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR,NCBIReferenceSequence:NC_006569.1。所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，基因型为：CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)。第二，本专利技术还提供上述转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌在合成法尼烯中的应用，所述基因工程菌可以转化纤维素水解液发酵产法尼烯，方法为：将所述的基因工程菌在固体活化培养基上活化后接种到一级种子培养基，活化培养后获得一级种子，将所得一级种子接种到二级种子培养基中进行种子培养得到二级种子，将二级种子接种到纤维素水解液发酵培养基中，发酵得到法尼烯。所述固体活化培养基为YPD固体培养基，含有20g/L的葡萄糖、10g/L的酵母粉和20g/L的蛋白胨，以及琼脂；所述活化，为30℃温度下静置2d。所述一级种子培养基和二级种子培养基均为YPD液体培养基，含有20g/L的葡萄糖、10g/L的酵母粉和20g/L的蛋白胨；所述活化培养，培养温度为30℃，培养方式为摇瓶，转速180rpm，培养时间为24h；所述种子培养，培养温度为30℃，培养方式为摇瓶培养，转速180rpm，培养时间为24h；所述一级种子接种到二级种子培养基中，一级种子占二级种子培养基的5vol％。所述发酵，发酵温度为30℃，发酵方式为摇瓶发酵，转速160rpm-180rpm，发酵时间为72-120h。所述二级种子接种到纤维素水解液发酵培养基中，二级种子占纤维素水解液发酵培养基的10vol％；发酵瓶的装液量不超过瓶总体积的1/10-1/5。所述纤维素水解液发酵培养基的制备方法为：生物质纤维素原料粉碎后加入蒸馏水配制成悬浮液，第一次调节pH为酸性，进行第一次高温处理；冷却到室温后，第二次调节pH为碱性，进行第二次高温处理；第三次调节pH为酸性，加入混合酶A，摇床中进行水解；冷却至室温后离心取上清得到纤维素水解液发酵培养基。所述生物质纤维素原料玉米秸秆、稻草、野草、柳枝稷中的一种或二种以上。上述原料为干燥的原料。所述粉碎，粉碎后60目筛。所述粉碎后的原料占加入的蒸馏水的5％(g/mL)。所述第一次调节pH为酸性，使用6M的H2SO4调节pH为3。所述第一次高温处理，处理温度为105℃，处理时间为10min。所述第二次调节pH为碱性，使用6M的NaOH调节pH为10。所述第二次高温处理，处理温度为105℃，处理时间为10min。所述第三次调节pH为酸性，使用6M的H2SO4调节pH为5。所述混合酶A，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和漆酶，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和漆酶在混合酶A中的质量比为3:1:1:3。所述混合酶A的质量占粉碎的生物质纤维素原料质量的16％。所述第一次水解，水解温度为50℃，水解时间为3d。所述离心，转速10000rpm/min，离心时间20min。法尼烯产物检测：发酵结束后，通过气相色谱GC或气相色谱-质谱联用仪GC-MS对发酵产物法尼烯进行分析测定。GC检测系统为安捷伦7890A型气相色谱仪，毛细管色谱柱Agilent-DB-5MS，规格为30m×0.25mm×0.25μm。升温程序为：初始柱温为60℃，维持0.75min；以40℃/min升温速度升至300℃，维持6min；检测器温度320℃，气化室温度为250℃。本专利技术有益效果：...

【技术保护点】
1.一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌整合了法尼烯合成酶基因AaFS，磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，磷酸转酮酶基因LmPK，乙醛脱氢酶基因DzeutE，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR。/n

【技术特征摘要】
1.一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌整合了法尼烯合成酶基因AaFS，磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，磷酸转酮酶基因LmPK，乙醛脱氢酶基因DzeutE，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR。


2.根据权利要求1所述的转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述法尼烯合成酶基因AaFS，GenBank:AY835398.1；磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，GenBank:CP018335.1；磷酸转酮酶基因LmPK，GenBank:AY804190.1；乙醛脱氢酶基因DzeutE，GenBank:CP006929.1；羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR,NCBIReferenceSequence:NC_006569.1。


3.根据权利要1或2所述的转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，基因型为：CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)。


4.一种权利要求1-3任意一项所述的转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌在合成法尼烯中的应用，其特征在于，将所述的基因工程菌在固体活化培养基上活化后接种到一级种子培养基，活化培养后获得一级种子，将所得一级种子接种到二级种子培养基中进行种子培养得到二级种子，将二级种子接种到纤维素水解液发酵培养基中，发酵得到法尼烯。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述一级种子培养基和二级种子培养基均为YPD液体培养基，含有20g/L的葡萄糖、10g/L的酵母粉和20g/L的蛋白胨；所述活化培养，培养温度为30℃，培养方式为摇瓶，转速180rpm，培养时间为24h；所述种子培养，培养温度为30℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，刘丽娟，张海波，齐畅，曹小贺，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37