脂肪酶生产菌株及其应用制造技术

本申请提供了脂肪酶生产菌株及其应用。具体地，本申请提供了甘油单‑二酰酯脂肪酶生产菌株，并提供了由该菌株制备甘油单‑二酰酯脂肪酶的方法及其应用。本申请提供的脂肪酶生产菌株稳定、蛋白产量高且产泡沫量少，具有极大的工业化生产价值。

【技术实现步骤摘要】
脂肪酶生产菌株及其应用
本申请属于生物
，具体涉及脂肪酶生产菌株及其应用，更具体地，涉及产泡沫量少的甘油单-二酰酯脂肪酶生产菌株及其应用。
技术介绍
自1969年研究人员首次发现某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长并且可以进行高密度发酵以来，随着甲醇诱导启动子PAOX1的发现和毕赤酵母分子操作方法的成熟，使用毕赤酵母表达外源蛋白得到广泛应用。由于毕赤酵母既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白的翻译后修饰如糖基化、蛋白磷酸化等特点，同时它还避免了其他酵母如酿酒酵母分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，该表达系统很快成为目前最优秀、应用最为广泛的外源基因表达系统之一。目前有超过5000种蛋白在毕赤酵母中成功表达，美国FDA于2006年将毕赤酵母认定为一般公认安全(GRAS)的菌株，用于生产作为动物饲料添加剂的磷脂酶C。毕赤酵母基础菌株GS115来自化学法诱变原始菌NRRL-Y11430(ATCC76273)，使之成为组氨酸营养缺陷型宿主(His-)，便于进行克隆筛选。GS115的醇氧化酶基因AOX1是完整的，虽然其能够很好地利用甲醇表达大多数外源蛋白，但由于其本底AOX1依然会高效表达，因而会影响某些基因的产量。因此，后续毕赤酵母衍生菌株方向之一就是在GS115的基础上将AOX1基因敲除，替换成酿酒酵母ARG4基因，得到KM71(his4arg4aox1Δ::ARG4)，由于其AOX2基因保持完整，因此甲醇利用率很低，在甲醇作为唯一碳源的培养下生长很慢。进一步敲除AOX2基因后，得到了无法利用甲醇的宿主MC100-3(his4arg4aox1Δ::SARG4aox2Δ::Phis4)。在GS115的基础上改造的另一个方向是失活宿主蛋白酶，包括敲除毕赤酵母液泡蛋白酶B(ProteinaseB，prb1)，得到SMD1165(his4prb1)；或者敲除用于激活其他液泡蛋白酶(包括羧肽酶Y(carboxypeptidaseY)和蛋白酶B)的液泡天冬氨酸蛋白酶(PEP4)，得到SMD1168(his4pep4)。在SMD1168的基础上进一步敲除液泡蛋白酶B(ProteinaseB，prb1)，得到SMD1163(his4pep4prb1)。脂肪酶是酯酶的一种，可以催甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、其它小分子酯、多元醇酯和多元酸酯酯键的水解，脂肪为脂肪酶的天然底物，水解的过程中会产生甘油二酯和甘油单酯，水解最终产物为甘油和脂肪酸。脂肪酶水解条件温和，副产物少，不需要辅酶。脂肪多为疏水物质，因此水解反应发生在油水界面或者有机相中。甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)是脂肪酶的一种，MDGL具有底物特异性，仅作用于甘油单酰酯(MAG)和甘油二酰酯(DAG)，对甘油三酰酯不起催化作用，可以利用酯化或转酯化反应来生产具有较高工业价值的甘油单酰酯。甘油单酰酯(MAG)是一种优良的乳化剂，在食品、医药和化妆品工业中有广泛的应用。MAG的传统合成工艺是在高温下，以无机碱为催化剂，在氮气条件下通过油脂/甘油三酯(TAG)与甘油连续酯化进行生产，产物为MAG、DAG和TAG的混合物，通过蒸馏获得MAG，MAG的产率为40-50％。Yamaguchi等(Purificationandcharacterizationofmono-anddiacylglycerollipaseisolatedfromPenicilliumcamembertiiU-150，AppliedMicrobiologyandBiotechnology,1991,34(6):720-725)首先利用卡门柏青霉获得了MDGL，MDGL有2种形态，分子量分别为37KDa和39KDa，MDGL有由26个氨基酸组成的信号肽，成熟肽包含279个氨基酸。Yamaguchi等以月桂酸乙烯酯为底物测定卡门柏青霉来源的MDGL酶活单位，经培养基过滤、乙醇纯化、硫酸铵沉淀、DEAE琼脂糖凝胶过滤、纤维素膜纯化和离子交换等纯化步骤后，MDGL的比酶活为6680U/mg。MDGL由mdlA编码，mdlA已经在毕赤酵母中获得表达。与传统合成工艺不同，酶法合成MAG是以脂肪酸和甘油为底物，在温和条件下催化合成MAG，酶法催化中脂肪酸的转化率超过97％，MAG在产物中的占比超过74％。目前限制酶法应用的主要问题是酶的活力较低和酶的成本较高。由于培养基中存在糖、蛋白质和代谢物等稳定泡沫的物质，在通气发酵和微生物呼出二氧化碳的共同作用下，培养液会产生泡沫，泡沫的产生会影响搅拌、溶氧和细胞生长等，如果泡沫控制不当，泡沫溢出，会引起一系列问题，包括降低装料系数，增加染菌风险，造成原料的浪费以及产物的损失，最终导致发酵产率降低。泡沫可通过1)调整培养基成分，改变发酵参数，调整发酵工艺，2)采用机械消泡器、超声波等物理手段消除，3)采用化学消泡剂，4)从微生物本身的特性着手，筛选不易产生泡沫的突变菌种，从内在因素上消除气泡。微生物发酵过程中通常通过添加消泡剂来减少泡沫的产生，目前常用的消泡剂包括：烷氧基脂肪酸酯，聚丙烯乙二醇(PPG)，硅氧烷聚合物，矿物油和硅酸盐等。各种消泡剂在不同发酵液中的消泡效果各不相同，使用量也各有不同，如以谷氨酸发酵为例，产酸10％的发酵水平，每生产1t谷氨酸就要使用5kgGPE消泡剂；产酸12％以上的发酵水平，就要采用更大量消泡剂。消泡剂用量的增加，不但抑制微生物的活力，造成溶氧系数下降，还会影响发酵产物的质量(章冬梅等，泡沫对工业发酵的影响及控制，化工设计，2008，18(1)：17-20)。甲醇营养型巴斯德毕赤酵母常使用硅氧烷聚合物为消泡剂，一般需要10ppm的聚二甲基硅氧烷才能有效的抑制泡沫。对于降低发酵成本而言，减少消泡剂的使用是比较好的改进。
技术实现思路
因此，一方面，本申请提供了一种脂肪酶生产菌，其为经表达甘油单-二酰酯脂肪酶的质粒转化的产泡沫量少的巴斯德毕赤酵母。在一实施方案中，本申请提供的脂肪酶生产菌中的质粒包含如SEQIDNO.:1所示的表达甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列。在一实施方案中，本申请提供的脂肪酶生产菌中的质粒还包含如SEQIDNO.:3所示的表达液泡天冬氨酸蛋白酶的核苷酸序列。在一具体实施方案中，本申请提供的脂肪酶生产菌已于2018年11月05日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，分类命名为Pichiapastorismc1-2-MDGL-pep-28-3，其保藏编号为CGMCC16706。另一方面，本申请提供了获得所述脂肪酶生产菌的方法，其包括利用表达甘油单-二酰酯脂肪酶的质粒转化巴斯德毕赤酵母，并经筛选获得。在一实施方案中，本申请提供的获得所述脂肪酶生产菌的方法中所使用的质粒包含如SEQIDNO.:1所示的表达甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列。在一实施方案中，本申请提供的获得所述脂肪酶生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.脂肪酶生产菌，其为经表达甘油单-二酰酯脂肪酶的质粒转化的产泡沫量少的巴斯德毕赤酵母，其中所述表达甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；任选地，其中所述质粒还包含如SEQ ID NO.:3所示的表达液泡天冬氨酸蛋白酶的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.脂肪酶生产菌，其为经表达甘油单-二酰酯脂肪酶的质粒转化的产泡沫量少的巴斯德毕赤酵母，其中所述表达甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示；任选地，其中所述质粒还包含如SEQIDNO.:3所示的表达液泡天冬氨酸蛋白酶的核苷酸序列。


2.如权利要求1所述的脂肪酶生产菌，其保藏编号为CGMCC16706。


3.获得权利要求1或2所述的脂肪酶生产菌的方法，其包括利用表达甘油单-二酰酯脂肪酶的质粒转化巴斯德毕赤酵母，并经筛选获得。


4.权利要求1或2所述的脂肪酶生产菌在制备甘油单-二酰脂肪酶中的应用。


5.制备甘油单-二酰酯脂肪酶的方法，其包括发酵培养权利要求1或2所述的脂肪酶生产菌。


6.如权利要求5所述的方法，其中所述发酵培养包括添加甲醇诱导脂肪酶生产菌表达甘油单-二酰酯脂肪酶的步骤；任选地，其中所述添加甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵强，徐正军，宣姚吉，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31