长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用，其解决了现有长链二元酸菌种改造效果不显著的技术问题，其分类命名为假丝酵母菌(Candida sp.)TDTC019，其保藏编号为：CGMCC No.16660。本发明专利技术可广泛用于长链二元酸的制备领域。

Long chain dicarboxylic acid producing strain and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种菌种及其制备方法和应用，具体说是一种长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用。
技术介绍
长链二元酸是重要化工原料，具有极其广泛的用途，能够合成香料、特种尼龙、高级润滑油等一系列高附加值的化学品。长链二元酸可应用在军用领域、航空航天器的涂层、管路、汽车的表面涂层及油管等；在民用领域，可应用于汽车、日化香料、工程塑料、尼龙行业等十多个高新科技行业，可开发出更多的下游产业，形成新兴的产业链。以往，长链二元酸采用化学合成法生产，其专利技术被国外所拥有。化学合成法生产长链二元酸，不仅产品种类单一，且合成工艺复杂、成本高、污染大。我国是世界上唯一能够采用微生物发酵技术实现多种长链二元酸大规模工业化生产的国家。此前，我国二元酸生产菌种的改良均是通过不同方式诱变等传统育方法实现的。传统育种方法具有很大随机性，筛选复杂。通过传统育种的方法已经很难进一步提高菌株的性能。当前长链二元酸工业化生产过程中仍有许多瓶颈问题，如底物转化率有待提高、生产能耗非常巨大等等。代谢工程技术可以在基因水平上有针对性的进行菌种分子改造，获得性能更加优良的新菌株。如图1、图2所示，二元酸代谢途径主要包括ω-氧化途径和β-氧化途径，其中前者为二元酸合成途径，后者涉及二元酸降解途径。代谢工程的目的是通过分子改造手段来提高ω-氧化活性，并降低β-氧化活性。国际上，Henkel公司(后来的Cognis公司)有专利报道(US005254466A)，用基因敲除方式来优化二元酸生产菌株，依次将4个POX基因敲除，达到完全阻断β-氧化，使底物转化率提高为100％。在此基础上，该公司进一步通过代谢工程手段共表达CYP单加氧酶和还原酶，以达到增强ω-氧化的目的，产量提高30％(WorldPatentWO/91/06660)。但是利用该菌株进行批式发酵实验，其工艺仍无法与当时其他二元酸生产工艺竞争，而最终没有进行规模化生产。Henkel公司对菌种进行分子改造所使用的筛选标记为尿嘧啶营养缺陷型。Henkel公司专利技术专利的缺点为：1、出发菌株不是工业化生产所用的高产菌株；2、发酵法生产长链二元酸所用的假丝酵母为二倍体，即每个细胞具有两套染色体，每个基因都有对应的等位基因，而且催化每步体内生化反应的酶往往由多个基因编码。因此，通过代谢工程手段来增强或减弱某个体内生化反应的活性，需要对编码该酶的关键基因进行分子改造才有显著效果。否则，改造后效果也不会显著。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决现有菌株生产长链二元酸效果不显著的技术问题，提供一种生产效率高的长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用。为此，本专利技术提供一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candidasp.)TDTC019，所述菌株于2018年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；其保藏编号为：CGMCCNo.16660。本专利技术中的长链二元酸生产菌株等位基因CandidaA05236和CandidaA04467之一被敲除，所述等位基因的碱基序列如序列表的序列5和序列6所示。该基因为该菌株基因组中编码该酶的多个基因中对于长链二元酸生产最为关键的一个。本专利技术同时提供一种长链二元酸生产菌株的制备方法，其包括如下步骤：(1)准备引物HCD-F和HCD-R；(2)准备长链二元酸生产菌株感受态细胞；(3)使用步骤(1)中的引物进行扩增clonNAT抗性基因，利用扩增的产物对菌种中的等位基因CandidaA05236和CandidaA04467之一进行敲除，所述等位基因的碱基序列如序列表的序列5和序列6所示；(4)通过PCR扩增、纯化、电转、筛选、鉴定，得到长链二元酸生产菌株。优选地，本专利技术中长链二元酸生产菌株的制备方法，筛选步骤中使用的筛选标记为clonNAT。优选地，长链二元酸生产菌株的制备方法，步骤(2)中的长链二元酸生产菌株假丝酵母(Candidasp.)DC12。本专利技术同时提供长链二元酸生产菌株在生产长链二元酸中的应用。优选地，发酵结束后，将发酵液加热至70～80℃；再将pH调至9～9.5，除去菌体沉淀，保留上清；脱色，温度保持在70～90℃，得到滤清液，用酸酸化至pH2.5，70～90℃保温，冷却，离心或压滤，水洗，清洗后的沉淀取出后真空干燥，得到长链二元酸。本专利技术中的长链二元酸是指含有十个以上碳原子的直链二羧酸，是一种重要的精细化工中间原料，特别是十二碳二元酸(DC12)、十四碳二元酸(DC14)、十六碳二元酸(DC16)和十八碳二元酸(DC18)。本专利技术的有益效果是，为了突破生产菌种遗传改造的瓶颈，本专利技术通过解析生产菌株的基因组学和转录组学特征，分析ω-氧化和β-氧化代谢途径，在基因组全局水平上确立了二元酸代谢相关的一些关键靶位点，再通过代谢工程手段对这些位点进行分子改造，并经过发酵实验验证，获得了性能更加优良的菌株。本专利技术的TDTC019菌株(保藏号：CGMCCNo.16660)，相比DC12菌株，转化率得到明显提高，为规模化生产带来有益效果。附图说明图1为本专利技术涉及到的长链二元酸合成相关ω-氧化代谢途径；图2为本专利技术涉及到的长链二元酸降解相关β-氧化代谢途径；图3为本专利技术涉及到的基因敲除流程图；图4为HPLC分析DC12发酵生产的长链二元酸；图5为HPLC分析TDTC023发酵生产的长链二元酸。本专利技术的长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candidasp.)TDTC019；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2018年10月31日，保藏号编号为：CGMCCNo.16660。具体实施方式序列表中的序列名称如下：序列1：HCD-F；序列2：HCD-R；序列3：HCD-U；序列4：HCD-D；序列5：CandidaA05236；序列6：CandidaA04467以下实施例中观察到的菌落及菌体形态归纳如下：固体培养基平板上，菌落奶酪状，表面光滑，乳白色，饱满凸起，菌落直径约为2mm。酵母样单细胞,大小约为10x6μm。大多情况下，以酵母样单细胞形式，同时会有假菌丝体形成，如在某些生长阶段或某种外界条件刺激下，假菌丝比例会显著增加。以下实施例中使用了下面所列的培养基：1、YPD培养基，其配方为：1％的酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，若制固体培养基，加入2％琼脂粉。上述百分比为质量体积百分比，即每100毫升培养基所需该组分的克数。若要添加抗生素，液体培养基在使用时加入至相应终浓度。固体培养基在高压灭菌后冷却至50摄氏度左右时，加入抗生素至相应终浓度，混匀后立刻倒如无菌的培养皿中，待凝固后倒置，放于4摄氏度冰箱，两周内使用。2、种子培养基的配方：酵母膏1～8g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candida sp.)TDTC019，其保藏编号为：CGMCC No.16660。/n

【技术特征摘要】
1.一种长链二元酸生产菌株，其分类命名为假丝酵母菌(Candidasp.)TDTC019，其保藏编号为：CGMCCNo.16660。


2.根据权利要求1所述的长链二元酸生产菌株，其特征在于所述假丝酵母菌的等位基因CandidaA05236和CandidaA04467之一被敲除，所述等位基因的碱基序列如序列表的序列5和序列6所示。


3.如权利要求1所述的长链二元酸生产菌株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)准备引物HCD-F和HCD-R；
(2)准备长链二元酸生产菌株感受态细胞；
(3)使用步骤(1)中的引物进行扩增clonNAT抗性基因，利用扩增的产物对菌种中的等位基因CandidaA05236和CandidaA04467之一进行敲除，所述等位基因的碱基序列如序列表的序列5和序列6所示；
(4)通过PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖小勤，晏礼明，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11