本发明专利技术提供了一种新细菌，为Acinetobacter属，属于微生物技术领域，同时，提供了其在生产十六碳二元酸中的应用，本发明专利技术提供的细菌能够生产十六碳二元酸，采用本发明专利技术提供的细菌生产十六碳二元酸，避免了现有技术中使用热带念珠菌生产DC16菌株的危害，本发明专利技术提供的新细菌发酵生产DC16的产率也大于现有技术中其他生物法制备的产率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高效生产DC16的细菌，同时涉及其制备DC16的方法，具体涉及利用培养法从石油污染土壤中，对能代谢正十六烷烃生成DC16的细菌进行富集、筛选、分离和鉴定，并对其代谢生产的DC16进行分离、纯化和测定。
技术介绍
DC16是一种重要合成原料，可以用来合成麝香酮，代替天然麝香，用于配制多种中成药。DC16在自然界中不存在，并且化工方法也很难合成，因此，生物代谢法成为生产DC16最有效的方法。到目前为止，生物法生产DC16均是利用热带假丝酵母菌(Candida cloacae)来完成，还没有发现利用细菌生产DC16的报道。用热带假丝酵母菌(Candida cloacae)发酵法制备DC16的报道最早出现在70年代， 如日本内尾等人用阴沟假丝酵母(Candida cloacae)MR-12 生产DC16。后来，陈元童利用热带假丝酵母(Candida cloacae)突变株UH-3-9生产DC16，通过向反应体系中添加丙烯酸，来抑制二羧酸的β-氧化，降低了热带假丝酵母(Candida cloacae)对已生成DC16的分解，提高了DC16的产率，发酵3天时DC16的产量达到了54 g/L，均高于高忠祥（1990）和植村（1987）报道的40 g/L左右的产量。曹务波（2011）等公开了利用热带假丝酵母(Candida cloacae)突变株ly-6发酵正十六烷生产DC16的专利技术专利，在补加正十六烷发酵165小时后, DC16的产率为170.5 g/L，转化率为88.1%。热带假丝酵母菌(Candida cloacae) ，即热带念珠菌，属隐球酵母目、隐球酵母科，是一种真菌,可引起急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病,并可导致皮肤、粘膜、内脏受到损害等。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种生产DC16的细菌，并提供了其具体的制备方法。本专利技术不但分离到一株能高效代谢生产DC16的新种菌，丰富了微生物资源库，而且DC16的发酵产率高于之前的研究，同时避免了使用热带假丝酵母菌发酵的危害。本专利技术所提供的细菌编号为STKD-1，属于不动杆菌 Acinetobacter sp.属，其菌株保藏号为CGMCCNo.11839，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址在北京市朝阳区北辰西路一号院3号，保藏日期为2015年12月9日。具体的本专利技术提供的细菌在制备十六碳二元酸中的制备步骤如下：（1）制备培养基发酵培养基II：正十六烷 1.5g/L，蛋白胨4.0g/L，(NH4)2SO4 0.15g/L ，KH2PO4 0.8g/L，NaCl 0.1g/L，去离子水1000mL，调pH 为7.2，分装到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 灭菌待用；液体筛选培养基：K2HPO4 1.5g/L，MgSO4 ·7H2O 0.5g/L, NH4NO3 1.5g/L, FeCl3 0.025g/L, 无水CaCl20.01g/L，正十六烷1.5 g/L，用2M的NaOH 调节pH 至 7.0，121 ℃ 20 min灭菌，待用；（2）发酵正十六烷发酵细菌的预培养过程：将菌株接种到液体筛选培养基中，28 ℃，150 rpm/min条件振荡培养3 d，得到预培养液；发酵过程：取预培养液20mL接种到3L发酵培养基II中，28 ℃，150 rpm/min振荡培养，每隔24 h用6 mol/L NaOH溶液调整发酵液pH至7.2，培养时间为20 d，发酵结束后取发酵液进行十六碳二元酸的提取及测定；（3）十六碳二元酸的提取将发酵液加热到85 ℃，边搅拌边用NaOH调整pH为11.0，趁热进行膜抽滤，所用滤膜为硝酸纤维素膜，孔径为0.22µm，收集抽滤液；将抽滤液在4 ℃条件下静置12 h，取抽滤液上部液体加入稀硫酸，调整pH为2.0，4 ℃条件下静置12 h，收集底部沉淀；取抽滤液下部沉淀加入去离子水溶解，用稀硫酸调整溶液pH至2.0，4 ℃条件下静置12 h，收集底部沉淀；合并两部分沉淀，低温真空干燥，即得总十六碳二元酸；（4）气质联用方法测定十六碳二元酸含量。本专利技术提供了一种能代谢产生DC16的新细菌，避免了现有技术中使用热带念珠菌生产DC16菌株的危害，同时，本专利技术提供的新细菌发酵生产DC16的产率大于现有技术中其他生物法的产率。附图说明图1为气质联用（GC-MS）测定D16结果；图2为高效发酵生产DC16菌株STDK-1的系统发育树。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1 1、细菌的富集取青岛黄岛区中石化加油站附近的被石油污染的土壤10 g放入到烧杯中，再向其中加入90 mL的去离子水浸泡并搅拌，静置30 min，取浸出液5 mL加入到100mL液体富集培养基中，28 ℃条件下振荡培养（150 rpm/min）5 d，得到富集培养液；富集培养基组成（/L）：牛肉膏3.0g， 蛋白胨10.0g， NaCl 5.0g，用NaOH调pH为7.6，121 ℃ 20 min灭菌待用；2、正十六烷发酵细菌的筛选与纯化筛选培养基组成（/L）：K2HPO4 1.5g，MgSO4 ·7H2O 0.5g, NH4NO3 1.5g， FeCl30.025g, 无水CaCl2 0.01g，正十六烷1.5g，琼脂20g，用2M的NaOH 调节pH 至 7.0，121 ℃ 20 min灭菌，趁热倒平板，冷却后即得固体平板培养基，半固体筛选培养基加入琼脂4g/L,其他成分及含量不变，液体筛选培养基不加琼脂；分离过程：取上述富集培养液20 µL滴加到固体平板培养基上，然后涂抹均匀，28 ℃条件下静置培养3 d，挑取生长快的5个单菌落再分别进行划线平板培养，所用平板培养基以及培养条件均同前，共得到5组平板。分别观察5组平板菌落特征，如菌落特征不一致，则继续重复划线培养，直至菌落特征一致，此时平板菌落为单一菌（纯菌）。通过上述多次划线培养，共分离出5株纯菌，记作STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5，分别将这5株纯菌4 ℃条件下保存在半固体筛选培养基中，待用；3、细菌的发酵产生DC16所用培养基组成（1）发酵培养基I组成（/L）：正十六烷2g，NaCl 0.5g, (NH4)2SO4 0.15g， MgSO4·7H2O 0.03g，NaNO3 0.1 g，NaH2PO4 0.5g，FeCl3 0.04 g，去离子水配制，用NaOH调pH为7.2，分装到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 灭菌待用；（2）发酵培养基II组成（/L）：正十六烷 1.5g，蛋白胨4.0g，(NH4)2SO4 0.15g ，KH2PO40.8g，NaCl 0.1g，去离子水1000mL，调pH 为7.2，分装到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 灭菌待用；（3）发酵培养基III组成（/L）：正十六烷 2.5 g， KH2PO4 1.5g， K2HPO4 2.0g，NH4 NO30.5g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，无水CaCl2 0.01g，FeSO4 0.002g，去离子水1000mL，调pH 为7.2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细菌，其为保藏号CGMCCNo.11839的Acinetobacter属菌株。
【技术特征摘要】
1.一种细菌，其为保藏号CGMCCNo.11839的Acinetobacter属菌株。2.权利要求1所述的细菌在制备十六碳二元酸中的应用，具体步骤如下：（1）制备培养基发酵培养基II：正十六烷 1.5g/L，蛋白胨4.0g/L，(NH4)2SO4 0.15g/L ，KH2PO4 0.8g/L，NaCl 0.1g/L，去离子水1000mL，调pH 为7.2，分装到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 灭菌待用；液体筛选培养基：K2HPO4 1.5g/L，MgSO4 ·7H2O 0.5g/L, NH4NO3 1.5g/L, FeCl3 0.025g/L, 无水CaCl20.01g/L，正十六烷1.5 g/L，用2M的NaOH 调节pH 至 7.0，121 ℃ 20 min灭菌，待用；（2）发酵正十六烷发酵细菌的预培养过程：将菌株接种到液体筛选培养基...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆洪省，冯晓寒，刘亚樵，于梦梦，
申请(专利权)人：山东科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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