一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸中的应用。本发明专利技术提供的工程菌，是将出发菌进行如下（a）和（b）的改造得到的重组菌：（a）灭活PHA合成酶基因；（b）导入硫酯酶基因；所述出发菌为产聚羟基脂肪酸酯的细菌。利用本发明专利技术提供的工程菌以某一中长链脂肪酸为单一碳源时，发酵液中可得到高产量、高纯度的、与提供脂肪酸碳源的结构高度一致的3-羟基脂肪酸产物。本发明专利技术的方法可用于高产量、高纯度的3-羟基脂肪酸的生产，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及属于基因工程和微生物发酵的领域，具体涉及一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸(3-HA)中的应用。
技术介绍
3-羟基脂肪酸(3-HA)是新型生物材料聚羟基脂肪酸酯(PHA)的常见单体。由于其特殊的手性结构，3-羟基脂肪酸在药物、抗生素、维生素、香料及信息素的合成中可做为重要的前体。根据碳链骨架的长度，3-羟基脂肪酸可分为短链和中长链两类前者的碳链长度 为3-5，后者的碳链长度为6-14。其中中长链3-羟基脂肪酸可作为抗癌药物等重要药物合成的前体。3-羟基脂肪酸传统的生产方法是化学合成法，还可通过胞外PHA降解法和胞内PHA降解法等获得。由于这些方法工艺复杂、生产投入大、产物纯度不高，难以分离而导致生产成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸中的应用。本专利技术提供的工程菌，是将出发菌进行如下(a)和(b)的改造得到的重组菌(a)灭活PHA (聚羟基脂肪酸)合成酶基因；(b)导入硫酯酶基因；所述出发菌为产聚羟基脂肪酸酯的细菌。所述出发菌可为产聚羟基脂肪酸酯均聚物的细菌。所述PHA合成酶为将3-轻基脂肪酸乙酰辅酶A (3-hydroxyacyl-CoA)合成为聚羟基脂肪酸的酶。所述出发菌具体可为嗜虫假单胞菌LAC25，它是嗜虫假单胞菌L48的P -氧化代谢被削弱的突变体，其基因组中的fadA基因、fadB基因、PSEEN0664基因、PSEEN4635基因、PSEEN4636基因被敲除。所述“灭活PHA合成酶基因”是通过灭活PHA合成酶-降解酶操纵子基因实现的。所述PHA合成酶-降解酶操纵子基因包括phaCl基因、phaC2基因和phaZ基因；所述phaCl基因如序列表的序列I自5’末端第1-1680位核昔酸所不；所述phaZ基因如序列表的序列I自5’末端第1745-2584位核苷酸所示；所述phaC2基因如序列表的序列I自5’末端第2678-4357位核苷酸所示。所述PHA合成酶-降解酶操纵子基因具体如序列表的序列I所示。所述“灭活PHA合成酶-降解酶操纵子基因”具体可通过同源重组实现。用于所述同源重组的功能DNA片段中包括上游同源片段和下游同源片段。所述功能DNA片段中，在所述上游同源片段和所述下游同源片段之间还可具有筛选标记基因。所述筛选标记基因具体可为Gnf (硫酸庆大霉素抗性基因)基因。所述功能DNA片段中，所述上游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第10至510位核苷酸所示，所述下游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第1372至1835位核苷酸所示。所述Gnf基因具体可如序列表的序列4自5’末端第523-1356位核苷酸所示。所述功能DNA片段具体可如序列表的序列4自5’末端第10至1835位核苷酸所示。所述功能DNA片段具体通过重组质粒导入所述出发菌并与所述出发菌发生所述同源重组。所述重组质粒具体可为将所述功能DNA片段插入pKlSmobsacB质粒的多克隆位点得到的重组质粒。所述硫酯酶可如序列表的序列3所示或序列表的序列6所示。所述硫酯酶基因可如序列表的序列2或序列表的序列5所示。所述硫酯酶基因可通过质粒导入所述出发菌。 所述质粒为pSPH09质粒或重组质粒pZ⑶01。所述重组质粒pZ⑶01具体为将质粒中大肠杆菌来源的硫酯酶基因(该硫酯酶如序列表的序列3所示，该硫酯酶基因具体如序列表的序列2所示)替换为编码序列表的序列6所示蛋白质的DNA分子(具体为序列表的序列5所示的双链DNA分子)得到的重组质粒。所述重组质粒pZ⑶01具体为将质粒pSPH09的NdeI和EcoRI酶切位点之间的小片段替换为编码序列表的序列6所示蛋白质的DNA分子(具体为序列表的序列5所示的双链DNA分子)得到的重组质粒。本专利技术还保护一种工程菌，是将出发菌进行如下(a)和(b)的改造得到的重组菌Ca)灭活脂肪酸β氧化代谢途径相关基因和PHA合成酶基因；(b)导入硫酯酶基因；所述出发菌为产聚羟基脂肪酸酯的细菌。所述PHA合成酶为将3-轻基脂肪酸乙酰辅酶A (3-hydroxyacyl-CoA)合成为聚羟基脂肪酸的酶。所述产聚羟基脂肪酸酯的细菌为能产一种或多种单体碳链长度不少于6的中长链单体轻基脂肪酸酯的菌株，优选为假单胞菌属(Pseudomonas spp)菌株,更加优选为嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila),进一步优选为嗜虫假单胞菌L48。所述“灭活PHA合成酶基因”是通过灭活PHA合成酶-降解酶操纵子基因实现的。所述PHA合成酶-降解酶操纵子基因包括phaCl基因、phaC2基因和phaZ基因；所述phaCl基因如序列表的序列I自5’末端第1-1680位核昔酸所不；所述phaZ基因如序列表的序列I自5’末端第1745-2584位核苷酸所示；所述phaC2基因如序列表的序列I自5’末端第2678-4357位核苷酸所示。所述PHA合成酶-降解酶操纵子基因具体如序列表的序列I所示。所述“灭活PHA合成酶-降解酶操纵子基因”具体可通过同源重组实现。用于所述同源重组的功能DNA片段中包括上游同源片段和下游同源片段。所述功能DNA片段中，在所述上游同源片段和所述下游同源片段之间还可具有筛选标记基因。所述筛选标记基因具体可为Gnf (硫酸庆大霉素抗性基因)基因。所述功能DNA片段中，所述上游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第10至510位核苷酸所示，所述下游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第1372至1835位核苷酸所示。所述Gnf基因具体可如序列表的序列4自5’末端第523-1356位核苷酸所示。所述功能DNA片段具体可如序列表的序列4自5’末端第10至1835位核苷酸所示。所述功能DNA片段具体通过重组质粒导入所述出发菌并与所述出发菌发生所述同源重组。所述重组质粒具体可为将所述功能DNA片段插入pKlSmobsacB质粒的多克隆位点得到的重组质粒。所述硫酯酶可如序列表的序列3所示或序列表的序列6所示。所述硫酯酶基因可如序列表的序列2或序列表的序列5所示。所述硫酯酶基因可通过质粒导入所述出发菌。所述质粒为pSPH09质粒或重组质粒pZ⑶01。所述重组质粒pZ⑶01具体为将质粒中大肠杆菌来源的硫酯酶基因(该硫酯酶如序列表的序列3所示，该硫酯酶基因具体如序列表的序列2所示)替换为编码序列表的序列6所示蛋白质的DNA分子(具体为序列表的序列5所示的双链DNA分子)得到的重组质粒。所述重组质粒pZ⑶01具体为将质粒pSPH09的NdeI和EcoRI酶切位点之间的小片段替换为编码序列表的序列6所示蛋白质的DNA分子(具体为序列表的序列5所示的双链DNA分子)得到的重组质粒。本专利技术还保护以上任一所述工程菌在生产3-羟基脂肪酸中的应用。所述3-羟基脂肪酸具体可为3-羟基癸酸(3HD )、3-羟基十二酸(3HDD )或3-羟基十四酸(3HTD )。 假单胞菌是生产中长链聚羟基脂肪酸酯的主要菌种。脂肪酸3 -氧化代谢循环是其获得聚羟基脂肪酸酯合成前体3-羟基脂肪酸乙酰辅酶A (3-hydroxyacyl-CoA)的重要途径。抑制或敲除产PHA菌中的与￠-氧化代谢途经相关基因可以提高PHA中特定单体组分的含量。3-hydroxyacyl - CoA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工程菌，是将出发菌进行如下（a）和（b）的改造得到的重组菌：（a）灭活PHA合成酶基因；（b）导入硫酯酶基因；所述出发菌为产聚羟基脂肪酸酯的细菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国强，郑美，曾国栋，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：