异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法，构建方法为：利用同源重组方法，向解脂耶氏酵母中导入优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1、优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12和优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，得到重组菌1；向重组菌1中导入截短的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、鲨烯合酶编码基因Erg9和优化的羽扇豆醇合酶的编码基因opAtLUP1得到重组菌2；实验证明本发明专利技术的方法构建的异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母具有高的白桦脂酸的产量。

Recombinant yeasts for lipolysis of betulinic acid and its construction

【技术实现步骤摘要】
异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及异源合成羽扇豆醇和白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法。
技术介绍
白桦脂酸(Betulinicacid，缩写为BA)是一种羽扇烷型五环三萜，存在于白桦树(Betulapubescens)等多种植物中，具有诸多药理活性如抗肿瘤、抗病毒、抗疟疾等。由于白桦树皮、悬铃木树皮、蜡烛树皮中的BA含量极少，因此，BA的生产和制备主要通过提取白桦脂酸前体白桦脂醇，进一步通过化学转化或微生物转化合成白桦脂酸，然而这类方法存在以下几个缺点。1)原料短缺。白桦树皮、悬铃木树皮、蜡烛树皮生长周期长，且易受到农药残留污染，导致产品品质无法满足国内外市场需求。2)白桦树皮、悬铃木树皮、蜡烛树皮提取物成分复杂，分离纯化成本较高。3)制备过程往往伴随着对环境的高污染。因此，利用合成生物学的方法，通过微生物发酵生产白桦脂酸将从根本上解决上述问题。白桦脂酸的合成路径清晰，路径中的关键酶研究透彻，因此近几年，利用酿酒酵母从头合成白桦脂酸的研究已逐步开展。章焰生课题组从2012年开始至今已发表数篇研究酿酒酵母异源白桦脂酸的文章，2012年，其课题组鉴定长春花(Catharanthusroseus)C-28位氧化酶CrAO(即长春花CYP716AL1)，并将基因AtLUP1和CYP716AL1导入基因组已整合AtCPR1基因的酿酒酵母WAT11菌株中，构建基因工程菌株，在酿酒酵母中成功合成出白桦脂酸，但产量较低，仅0.1mg/L。脂肪酸合成途径与萜类合成途径共同使用乙酰辅酶A，因此调节脂肪酸途径有利于萜类合成，2013年，其课题组通过调节白桦脂酸和脂肪酸途径中不同的关键基因，得到九株基因工程菌株，产量为0.1mg/L到10mg/L不等。2014年，其课题组通过辅因子调节，将白桦脂酸产量提高至15mg/L。2016年，其课题组鉴定白桦树C-28位氧化酶BPLO，有报道表明酿酒酵母CEN.PK作为底盘菌株更有利于萜类合成，因此他们在不同底盘WAT11和CEN.PK中导入基因AtLUP1和BPLO，发现WAT11更适用于白桦脂酸的合成，产量为0.16mg/L/OD600(0.8mg/L)，后突变白桦脂酸合成途径中基因的半乳糖诱导型启动子，将产量提高为原来的两倍。解脂耶氏酵母是除酿酒酵母外的非常规酵母，安全菌株，分子操作手段成熟，异源蛋白表达量大，构建成功的菌株不易退化，底物利用范围广，能利用亲水碳源和疏水碳源。解脂耶氏酵母内含为萜类化合物合成提供前体的MVA途径，能合成白桦脂酸前体2,3-氧化鲨烯，然而，利用合成生物学方法在解脂耶氏酵母中异源合成羽扇豆醇和白桦脂酸还未见报道。本研究获得了异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法，探索新的底盘菌株合成白桦脂酸，为白桦脂酸工业化生产贡献一定的力量。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母。本专利技术的第二个目的是提供一种异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。本专利技术的技术方案概述如下：异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：(1)利用同源重组方法，向解脂耶氏酵母中导入优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1、优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12和优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，得到重组菌1；所述优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。(2)向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、鲨烯合酶编码基因Erg9和优化的羽扇豆醇合酶的编码基因opAtLUP1得到重组菌2；所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1是编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG15'端截了1500个核苷酸得到；所述编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的核苷酸序列如SEQIDNO.54所示；所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述鲨烯合酶编码基因Erg9的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。上述方法制备的异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母。本专利技术的优点：利用合成生物学方法在解脂耶氏酵母中异源合成白桦脂酸还未见报道。本专利技术获得了异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法，探索新的底盘菌株合成白桦脂酸，为白桦脂酸工业化生产贡献一定的力量。实验证明本专利技术的方法构建的异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母具有高的白桦脂酸的产量。具体实施方式解脂耶氏酵母YarrowialipolyticaATCC201249，以下简称解脂耶氏酵母。购买时间，2017.6，网址：https://www.atcc.org/下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1.解脂耶氏酵母重组菌1的构建向解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica，美国ATCC201249)中导入优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1、优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12和优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，得到重组菌1；优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。一、模块构建羽扇豆醇合酶编码基因(Lupeolsynthase,AtLUP1)来源于植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)，基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，得到优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。细胞色素P450酶编码基因(CYP716A12)来源于植物蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula),基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，得到优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。细胞色素P450还原酶1的编码基因AtCPR1来源于拟南芥，基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：/n(1)利用同源重组方法，向解脂耶氏酵母中导入优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1、优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12和优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，得到重组菌1；/n所述优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n所述优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；/n所述优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n(2)向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、鲨烯合酶编码基因Erg9和优化的羽扇豆醇合酶的编码基因opAtLUP1得到重组菌2；/n所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1是编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1 5'端截了1500个核苷酸得到；所述编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；/n所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；/n所述鲨烯合酶编码基因Erg9的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。/n...

【技术特征摘要】
1.异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)利用同源重组方法，向解脂耶氏酵母中导入优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1、优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12和优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，得到重组菌1；
所述优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
所述优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
所述优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
(2)向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，张传波，孙杰，鞠海燕，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12