ATRP法构建高转染类脂质体阳离子基因载体制造技术

本发明专利技术公开了一种基于脂质(胆固醇、磷脂酰肌醇等)结合一般所用的活性聚合方法得到的阳离子基因载体构建的一系列具有高转染、低毒性等优异性能的类脂质体基因载体。本方法简单易行，其聚合方法保证了分子量的有效可控，而且相对于一般的阳离子基因载体，此基因载体通过脂质基体有效的与细胞膜相容的特点，或者本身构建成为脂质体增加细胞的摄取量的特点，从而增加细胞的转染效率。通过本方法构建的一系列类脂质体的阳离子基因载体在HepG2、COS7、C6、SL、H9C2等细胞系中都有良好的转染效率，同时在高于国际上已经投入商业化使用的脂质体lipfect2000的转染效率，并且能够有效的解决脂质体lipfect2000在体内转染效率较差的难题，具有很高的商业化潜力。

【技术实现步骤摘要】
ATRP法构建高转染类脂质体阳离子基因载体
本专利技术属于非病毒基因载体制备
，具体涉及一种ATRP法构建一系列以脂质(胆固醇、磷脂酰肌醇等)为基体，具有高效基因转染效率的类脂质体阳离子基因载体。
技术介绍
基因治疗在过去的二十年内被人们认定为一种全新有效的治疗手段，这种方法对于未来医疗有着举足轻重的作用，被广泛的用于治疗一系列遗传性疾病、人类癌症和心血管疾病等等。整个基因治疗从广义上讲就是通过基因载体将用于治疗的外源设计基因或者寡聚核苷酸片段引入病体中的病变细胞，从而表达以改善病变细胞的缺陷，从而达到治疗的目的。基因治疗的整个流程有三个重要环节，其中包括目的基因的设计、基因载体的研发以及目的基因是否能在细胞中特异性表达。其中，基因载体的研发是重中之重，正是因为缺乏安全高效的基因载体才导致了基因治疗实施的瓶颈。基因载体作为将外源基因导入到细胞的工具，其本身应该低毒性并且不会引起免疫反应；其次，其要能跟基因形成具有稳定结构的复合物，同时也不会导致基因结构的变化；最后，这种载体最好能够具有一定的靶向和降解作用，这样可以针对特定的细胞进行治疗并且可以降低其由于滞留导致的副作用。目前人们广泛使用的基因载体包括两类：病毒载体(viralvector)和非病毒载体(non-viralvector)。病毒载体主要包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒以及单纯疱疹病毒。这种病毒载体一般能够轻易的克服细胞屏障和免疫防御机制，从而其具有很高的转染效率。但是这种载体缺乏安全性，很容易引起致癌作用与自身免疫反应(unexpectedimmuneresponse)和白细胞的病毒变化，严重时会造成器官衰竭从而导致死亡。同时病毒载体还会引起插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化，而且病毒载体携带基因的能力有限，不利于大规模工业生产。针对以上病毒载体的缺点，人们将更多的目光投向了非病毒载体。其本身安全性能高，很多具有生物相容性或者具有生物可降解能力的基因载体都是低毒性的，而且具有很低的免疫毒性。相对于病毒载体而言，虽然这种非病毒性载体的转染效率并不是很高，有的时候很难克服细胞内外的各种屏障，但是其能够携带更多的基因，同时还能大规模工业化生产，具有很高的商业潜力。所以其发展潜力推动了非病毒载体的研究与开发。目前而言阳离子聚合物是人们使用频率最高的非病毒载体。这种阳离子非病毒性载体可以有效的通过电荷的相互作用络合上基因，从而形成带正电荷纳米级的复合体(complex)，从而能够保护基因穿过细胞膜以防止被核酸酶所降解，从而保证基因的顺利表达。近年来，活性/可控自由基聚合(living/controlledradicalpolymerization，LRP)逐渐开始成为聚合物合成的重点手段，其通过在聚合体系中引入特殊的化合物，使其与活性种链自由基进行可逆的链终止或者链转移，从而建立活性种与休眠种的动态平衡，以实现在较低温度和简易操作下聚合产品分子量和分子量分布的可控，具有很高的实用价值。LRP主要包括以下几种方式：引发转移终止剂活性自由基聚合(Initiator-Transferagent-TerminatorLivingRadicalPolymerization)、稳定自由基聚合(StableFreeRadicalPolymerization，SFRP)、原子转移自由基聚合(AtomTransferRadicalPolymerization，ATRP)、可逆加成-裂解链转移聚合(ReversibleAddition-FragmentationChainTransferPolymerization，RAFT)。其中，ATRP是通过交替的“活化-去活”的可逆反应，在降低体系中游离基浓度的情况下尽量的控制不可逆终止反应程度，而这个过程中链增长的反应则不受到影响，从而实现“活性”聚合。ATRP的引发剂一般为常见的卤化烷烃，其反应温度适中，适用于大部分单体，而且整个过程不需要复杂的合成路线，相对于其他的活性聚合具有更多的优势。随着高分子科学的不断进步，如何将其与现代医学、生物学以及工程学等学科更好的相互交融与渗透成为人们现在重点解决的难题。而在基因治疗方面，高分子材料已经体现出了很高的利用价值。目前，文献报道过一系列的非病毒阳离子基因载体，包括聚-L-赖氨酸(Poly(L-Lysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物(Poly(amidamine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(Poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，PDMAEMA)、聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)等。其中PEI是阳离子非病毒载体中公认的“金标”。但是上述的阳离子聚合物仍然具有相当高的毒性，并且在体内的转染会受到严重的限制，大大限制了这些非病毒载体在临床医学中的应用。所以，开发低毒而高效阳离子聚合物成为现在研究非病毒基因载体的核心内容。目前比较流行的方案是在阳离子聚合物中插入生物相容性的成分，最常见的是聚乙二醇(PEG)以增加基因载体在体内的循环时间，同时降低毒性。而另一种常见的思路就是构建类脂质体的阳离子基因载体，其中向基因载体中引入脂质例如胆固醇(Cholesterol)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol)、脂溶性维生素(Fat-solubleVitamin)等。这些脂质的引入可以有效的增加生物相容性从而降低自身毒性，同时脂质可以促进整个体系形成类脂质体或者脂质体从而增加在体内的转染。但是，上述报道的非病毒载体的性能(比如安全性和转染效率)与实际的临床医学应用的要求还有相当大的距离。目前，已经商业化的基因载体只有脂质体lipfect2000和lipfect3000，但是其价格高昂，并且在体内的转染效率也很差，这两个缺陷导致了这种基因载体在临床治疗中无法有效应用。近几年研究者致力于ATRP理论和应用的研究工作，已经能够熟练的利用这种活性聚合手段得到一系列能够用于现代生物医学方面的聚合物材料，例如改性过的PEGDMAEMA、PEGMA等等，都是最新的阳离子基因载体研究成果，同时促进了活性可控聚合在医用生物高分子中的应用。脂质(Lipid)是指由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物，一般不溶于水而能被乙醚、氯仿、苯等非极性有机溶剂所溶解，包括油脂(甘油三酯)和类脂(磷脂、固醇类)。这类小分子物质通常化学结构有很大的差异，生理功能各不相同，但是都可以在水中相互聚集形成内部疏水的聚集体，而这种空腔型的结构就为现代医学的载药和基因携带提供了一定的条件。而且，脂类是人体所需要的重要营养素之一，与蛋白质、碳水化合物是产能的三大营养素，在供给人体能量方面起着重要作用。脂类也是人体细胞组织的组成部分，是细胞膜的骨架。同时它在体内还有多种作用，例如信号传递，参与免疫等等，是一种很好的生物相容性的分子。胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分，利用其与相似相容的特点可以有效的提高细胞膜的通透性，从而增加细胞对于基因载体的摄取量，最终实现转染效率的提升。磷脂酰肌醇在细胞中对于细胞形态、代谢调控、信号传导和细胞的各种生理功能起着非常重要的作用，利用其作为信号分子的作用可以有效的提高基因载体的转染效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种类脂质体阳离子基因载体的活性可控自由基聚合方法，其特征在于，该聚合方法的聚合反应体系包括脂质大分子引发剂、有机溶剂、单体、配体、CuBr或CuBr与CuBr2的混合物；其中单体与脂质大分子引发剂的质量比为0.001‑60，优选0.01‑50，更优选0.05‑40；配体与脂质大分子引发剂的质量比为0.01‑1.2，优选0.01‑1，更优选0.05‑1；CuBr与脂质大分子引发剂的质量比为0.001‑1.5，优选0.01‑1，更优选0.05‑0.08；CuBr与CuBr2的质量比为(3:1)‑(5:1)；有机溶剂与脂质大分子引发剂的质量比为50‑500，优选50‑450，更优选70‑400。

【技术特征摘要】
1.一种类脂质体阳离子基因载体的活性可控自由基聚合方法，其特征在于，该聚合方法的聚合反应体系包括脂质大分子引发剂、有机溶剂、单体、配体、CuBr或CuBr与CuBr2的混合物；其中单体与脂质大分子引发剂的质量比为0.001-60；配体与脂质大分子引发剂的质量比为0.01-1.2；CuBr与脂质大分子引发剂的质量比为0.001-1.5；CuBr与CuBr2的质量比为(3:1)-(5:1)；有机溶剂与脂质大分子引发剂的质量比为50-500；聚合反应完成后加入脂质大分子引发剂质量的100-300倍的水或者甲醇，或者暴露在空气中终止聚合；然后用乙醚、乙醇或者甲醇沉淀直到形貌变为固体；真空干燥除去乙醚、乙醇或者甲醇得到粉末状或者絮状的固体；将得到的粉末状或者絮状的固体进行开环反应：将得到的粉末状或者絮状的固体在30-35℃无氧环境下加入二甲基亚砜搅拌溶解，之后加入胺在80-90℃范围内进行开环反应；其中二甲基亚砜与得到的粉末状或者絮状的固体的质量比为200-500；胺与得到的粉末状或者絮状的固体的质量比为20-50；开环反应持续1-3天以后，用乙醚沉淀聚合物直到变为粘稠状固体，将固体放入真空干燥箱中抽干乙醚，随后加水，再冷冻干燥直至除去所有的水分，得到开环的类脂质体阳离子基因载体；所述的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯，和甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、N-异丙基丙烯酰胺中的一种或者几种；所述的配体为2,2’-联吡啶、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4’-...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐福建，许晨，俞丙然，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11