本发明专利技术公开了一种阳离子脂质体，是由DODAB、DPPC和DOPE按摩尔比(1‑5)：(1‑2)：(0.5‑1.5)制备而成。本发明专利技术还公开了由该阳离子脂质体制备的核酸类药物制剂。本发明专利技术制备的阳离子脂质体粒径均匀，脂质体聚集的现象明显降低，体系的稳定性提高。以本发明专利技术制备的阳离子脂质体作为基因载体进行基因转染时，其转染率高、细胞毒性小，而且对核酸药物的包封率高。
Cationic liposome, preparation method and application thereof
The invention discloses a cationic liposome, is composed of DODAB, DPPC and DOPE mol ratio (1 (5): 1 2 (0.5): 1.5) prepared. The invention also discloses a nucleic acid medicine preparation prepared by the cationic lipid. The cationic liposome prepared by the invention has uniform particle size, and the phenomenon of aggregation of the liposome is obviously reduced, and the stability of the system is improved. When the cationic liposome prepared by the invention is used as gene carrier for gene transfection, the transfection rate is high and the cell toxicity is small.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种阳离子脂质体及其制备方法与应用，属于基因治疗
技术介绍
随着分子生物学的发展以及人类基因组计划的完成，基因治疗为遗传性疾病、恶性肿瘤、艾滋病以及心脑血管疾病等严重威胁人类健康的重大疾病防治提供了一种极富前景的治疗方法。该方法是将正常基因或有治疗作用的基因通过特定方式导入靶细胞以纠正基因缺陷，最终达到治疗疾病的目的。与传统治疗方法相比，基因治疗可针对目的细胞进行特异性治疗，具有长期疗效。但由于外源基因进入细胞后易被核酸酶全部或部分降解，使外源基因表达效率降低，因此，选择安全高效的基因传递载体携带基因进入细胞并完成基因表达是实现基因治疗的关键。基因传递载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类，病毒载体尽管转染效率高，但是存在免疫原性、致癌性等多种弊端，限制了其在临床基因治疗上的应用。与病毒载体相比，非病毒载体具有安全性好、无免疫原性、导入基因容量大、易于规模化生产等优势，在临床应用和治疗过程中可以替代病毒载体，具有重要的应用潜力。因此，研制安全高效的非病毒基因载体是目前基因治疗中亟待解决的问题。阳离子脂质体是基因治疗常用的非病毒载体，其携带的基因转染无插入突变的危险，可携带大片段DNA，其介导的基因转移具有无毒无免疫原性、可重复转染、可容纳亲水性和疏水性物质、外源基因不易被降解等优点，因此，阳离子脂质体介导的基因转移被认为是最具发展前景的基因治疗方法。但是，阳离子脂质体载体材料的脂质组成成分、组成比例以及制备的工艺过程，都会影响到其作为基因载体时的转染效率，从而直接影响到其能否有效保护所携带的外源基因并完成穿膜-入核-表达这一完整的基因治疗过程。虽然国内外研究人员设计开发了多种阳离子脂质体载体材料，并将之应用于细胞转染中，但由于这些载体材料自身存在的不稳定性、转染效率低等特点，真正能广泛应用于临床的阳离子脂质体基因载体材料仍然很少。因此，构建安全高效的阳离子脂质体基因载体材料，实现其在基因治疗过程中的基因有效传递，对基因治疗手段的开发具有关键的意义。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的一个目的是提供一种阳离子脂质体及其制备方法。本专利技术的另一个目的是提供该阳离子脂质体在制备阳离子脂质体核酸类药物制剂中的用途。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种阳离子脂质体，所述阳离子脂质体是由双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比(1-5)：(1-2)：(0.5-1.5)制备而成。优选的，所述阳离子脂质体是由双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比3：1：0.5制备而成。本专利技术的第二方面，提供上述阳离子脂质体的制备方法，步骤如下：(1)将DODAB、DPPC和DOPE分别溶解于氯仿和甲醇混合溶剂中，混合后得混合溶液；(2)在通入氮气的条件下将所述混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，干燥，将干燥后的薄膜用蒸馏水洗膜，将得到的水化液进行第一次超声处理，得到脂质分散液；将脂质分散液冻融，冻融后进行第二次超声处理，即得阳离子脂质体。步骤(1)中，所述氯仿和甲醇混合溶剂中，氯仿和甲醇的体积比为1:1。步骤(2)中，所述第一次超声处理的时间为20～40min，进一步优选的为25～35min，最优选的为30min。优选的，所述第二次超声处理时间为10～20min，进一步优选的为15min。步骤(2)中，将得到的脂质体溶液进行反复冻融四次。实验发现，经4次重复冻融后，脂质体的粒径分布更加均匀，但是当冻融次数增加到5次，脂质体粒径变化很小。综合考虑处理效果和处理成本，选择冻融的次数为四次。本专利技术的第三方面，提供一种核酸类药物制剂，所述核酸类药物制剂包含上述的阳离子脂质体和待转染的核酸。所述核酸为DNA、RNA、siRNA或质粒中的任一种。所述阳离子脂质体和核酸的N/P为(4-12):1；优选为8：1。本专利技术的第四方面，提供上述核酸类药物制剂的制备方法，步骤如下：(1)按上述方法制备阳离子脂质体；(2)将阳离子脂质体在磷酸盐缓冲液或生理盐水中预平衡；预平衡后再加入待转染的核酸进行复合，即得核酸类药物制剂。步骤(2)中，所述平衡时间为0.5～2h，优选为0.5～1.5h。步骤(2)中，所述复合时间为0.5～5h，优选为0.5～2h。上述阳离子脂质体和/或核酸类药物制剂在制备由基因异常表达引起的相关疾病的治疗药物中的用途也是本专利技术的保护范围。本专利技术的设计构思：本专利技术针对不同阳离子脂质和中性脂质分子量及理化性质的不同，将各种脂质通过不同成分组成和不同比例组成进行复配考察。本专利技术的阳离子脂质体中，以DODAB为阳离子脂质，DPPC为空间稳定脂质，可以与DODAB结合形成稳定的双层膜结构，降低阳离子头部的细胞毒性作用；以DOPE作为调节流动性脂质，增强转染活力，而且在本专利技术的阳离子脂质体作为基因载体进行细胞后，DOPE还能诱导脂质体膜与内涵体膜融合，从而使核酸药物的释放。由于阳离子脂质体的脂质组成比例也会对阳离子脂质体作为基因载体时的转染效率产生影响，从而直接影响到其能否有效保护所携带的外源基因并完成穿膜-入核-表达这一完整的基因治疗过程，本专利技术还对DODAB、DPPC和DOPE的组成比例进行了优化筛选，结果发现，DODAB、DPPC和DOPE的摩尔比为(1-5)：(1-2)：(0.5-1.5)时，制备的阳离子脂质体作为基因载体的转染效率较佳。本专利技术采用薄膜分散法和冻融法相结合的技术方法，使得脂质体聚集现象降低，粒径较均匀，体系的稳定性更高。其中，在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使形成的脂质体膜破裂，冰晶的片层与破碎的膜同时存在，此状态不稳定，在缓慢融化过程中，暴露出的脂膜互相融合经过超声处理重新形成分散性更加均匀的脂质体。阳离子脂质体进行基因转染的前提是与待转染的核酸形成阳离子脂质体/核酸复合物，常规的阳离子脂质体与核酸进行复合时，阳离子脂质体需要过量才能将核酸实现完全包裹，因此需要消耗大量的阳离子脂质体，导致细胞毒性较大。本专利技术制备的阳离子脂质体其粒径均匀，荷正电多分布于脂质体表面，当二者比例为(4-12):1时即可基本实现对核酸的完全包裹，大大减少了阳离子脂质体的用量，降低了细胞毒性。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术从阳离子脂质成分、中性脂质成分、组成比例、制备工艺等方面，全面考察阳离子脂质体的稳定性、转染效率结果和细胞毒性，筛选、设计获得性质稳定、细胞毒性低，在多种细胞中转染效率高，与多种外源基因均可有效结合与释放的阳离子脂质体。(2)以本专利技术制备的阳离子脂质体作为基因载体进行基因转染时，其转染率高、细胞毒性小，而且对核酸药物的包封率高，可望开发应用作为高效的阳离子脂质体材料和基因转染试剂。附图说明图1：实施例1制备的阳离子脂质体的TEM图；图2：阳离子脂质体核酸类药物制剂的血清稳定性实验结果；其中：1为实施例4中样品1的血清稳定性实验结果，2-6分别为样品2-6的血清稳定性实验结果。具体实施方式结合实施例对本专利技术作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例1：阳离子脂质体的制备按摩尔比为3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质体是由DODAB、DPPC和DOPE按摩尔比(1‑5)：(1‑2)：(0.5‑1.5)制备而成。
【技术特征摘要】
1.一种阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质体是由DODAB、DPPC和DOPE按摩尔比(1-5)：(1-2)：(0.5-1.5)制备而成。2.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质体是由DODAB、DPPC和DOPE按摩尔比3：1：0.5制备而成。3.权利要求1或2所述的阳离子脂质体的制备方法，步骤如下：(1)将DODAB、DPPC和DOPE分别溶解于氯仿和甲醇混合溶剂中，混合后得混合溶液；(2)在通入氮气的条件下将所述混合液旋转吹干，使之形成一层均匀的薄膜，干燥，将干燥后的薄膜用蒸馏水洗膜，将得到的水化液进行第一次超声处理，得到脂质分散液；将脂质分散液冻融，冻融后进行第二次超声处理，即得阳离子脂质体。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氯仿和甲醇混合溶剂中，氯仿和甲醇的体积比为1:1。5.如权利要求3所述的制备方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘书花，魏云波，王利红，王兴民，丁尚志，刘静，
申请(专利权)人：山东省分析测试中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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