一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种产β‑胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述的产β‑胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因，最后将尿嘧啶和亮氨酸两个营养缺陷型筛选标记回补构建而成，最后通过连续补料发酵，β‑胡萝卜素的产量可以达到4.5g/L。本发明专利技术构建的解脂耶氏酵母基因工程菌，其操作简便，性能稳定可靠，能够应用于大规模的商业化生产，所得的β‑胡萝卜素能够被安全的利用，前景良好。

A \u03b2 - carotene producing genetically engineered yeasts for lipolysis and its application

【技术实现步骤摘要】
一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，是关于一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。
技术介绍
β-胡萝卜素是通过植物和微生物等合成的天然橙色色素，除了作为维生素A的前体以及在光合作用中发挥重要作用，该化合物具有诸多的生理效应，例如清除自由基，增强免疫应答，增强细胞间隙连接。目前，β-胡萝卜素在食品、水产养殖、化妆品和制药领域等有着广泛的应用：着色剂、食品添加剂、抗氧化剂、抗癌制剂以及预防心脏疾病等。β-胡萝卜素的生产方法主要有化学合成法、天然提取法和微生物发酵法。但化学合成β-胡萝卜素的路线很复杂，而且收率也不高；从马铃薯、胡萝卜、沙棘和玉米等天然来源中提取β-胡萝卜素受诸多条件的影响，如季节、气候等，而且这些植物来源的β-胡萝卜素含量较少，因此导致天然提取β-胡萝卜素产品成本很高，能量的高消耗及较低的提取效率阻碍了这些方法的实际使用。因此微生物发酵法生产β-胡萝卜素具有明显的优势。特别是随着生物技术的快速发展，利用微生物发酵生产β-胡萝卜素成为目前研究的热点之一。目前，一般通过外源引入β-胡萝卜素合成相关基因生物发酵法生产β-胡萝卜素。与酿酒酵母相比，在解脂耶氏酵母中进行β-胡萝卜素的生产的报道并不多。但解脂耶氏酵母作为一种油脂酵母可以为类胡萝素提供储存空间，具有广泛利用底物的能力，是公认的安全性菌株，因此亟需开发β-胡萝卜素合成的解脂耶氏酵母基因工程菌。
技术实现思路
本专利技术将基因carRP和基因carB转化解脂耶氏酵母能够使其产β-胡萝卜素，在此基础上过表达了基因GGS1基因、基因HMG及基因ERG13，能够极大地提高β-胡萝卜素的产量。最后，将尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型筛选标记进行回补成功获得了产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母生产菌株。因此，本专利技术的第一个目的是提供一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌。本专利技术的第二个目的是所述产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌在构建类胡萝卜素的基因工程菌中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种所述产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。为了达到上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：作为本专利技术的第一个方面，一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK2，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中构建而成，所述carRP基因的核苷酸序列如SEQIDNO:55所示；所述carB基因的核苷酸序列如SEQIDNO:56所示。根据本专利技术，敲入carRP基因和carB基因的两组质粒对分别为pHR_XPR2_carRP和pCRISPRyl_XPR2及pHR_D17_carB和pCRISPRyl_D17。一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK3，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，构建获得解脂耶氏酵母基因工程菌XK2，再敲入GGS1基因构建获得。根据本专利技术，所述解脂耶氏酵母基因工程菌XK3是将质粒pHR_A08_GGS1和pCRISPRyl_A08转化解脂耶氏酵母基因工程菌XK2后构建获得。一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK4，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因和HMG基因构建而成。根据本专利技术，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK4是将质粒pHR_AXP_HMG和pCRISPRyl_AXP转化解脂耶氏酵母基因工程菌XK3后构建获得。一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK5，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因和1个拷贝的carB基因构建而成。根据本专利技术，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK5，其是将质粒pHR_POX2_carB和pCRISPRyl_POX2依次转化解脂耶氏酵母基因工程菌XK4中构建获得。一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK6，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成。根据本专利技术，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK6，其是将质粒pHR_MFE1_carRP和pCRISPRyl_MFE1依次转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK5中构建获得。一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK7，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成。根据本专利技术，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK7，其是将pHR_POX3_carRP和pCRISPRyl_POX3依次转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因构建而成。根据本专利技术，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17，其是将质粒pHR_LIP1_ERG13和pCRISPRyl_LIP1转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK7中构建获得。一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK19，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因，最后将尿嘧啶和亮氨酸两个营养缺陷型筛选标记回补构建而成。根据本专利技术，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK19，其是将线性化pINA1269质粒转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK17中回补亮氨酸筛选标记；之后将线性化pINA1312质粒转入已回补亮氨酸筛选标记的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17中回补尿嘧啶筛选标记，构建获得。一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK10，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG13基因构建而成。根据本专利技术，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌XK10，其是将质粒pHR_LIP1_ERG13和pCRISPRyl_LIP1转入解脂耶氏酵母基因工程菌XK6中构建获得。一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK11，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG10-11099基因构建而成。根据本专利技术，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌X本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因和HMG基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因和1个拷贝的carB基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因，最后将尿嘧啶和亮氨酸两个营养缺陷型筛选标记回补构建而成，或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG13基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG10-11099基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG10-08536基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG8基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG19基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和IDI基因构建而成；或者，/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG12基因构建而成；/n所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因和2个拷贝的carB基因构建而成；/n所述carRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：55所示；所述carB基因的核苷酸序列如SEQID NO:56所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因和HMG基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因和1个拷贝的carB基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、两个拷贝的carRP基因和1个拷贝的carB基因、ERG13基因，最后将尿嘧啶和亮氨酸两个营养缺陷型筛选标记回补构建而成，或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG13基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG10-11099基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG10-08536基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG8基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG19基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和IDI基因构建而成；或者，
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因、1个拷贝的carB基因和ERG12基因构建而成；
所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将carRP基因和carB基因敲入尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入GGS1基因、HMG基因、1个拷贝的carRP基因和2个拷贝的carB基因构建而成；
所述carRP基因的核苷酸序列如SEQIDNO：55所示；所述carB基因的核苷酸序列如SEQIDNO:56所示。


2.如权利要求1所述的产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Po1f；所述carRP基因、carB基因、GGS1基因、HMG基因、ERG13基因、ERG10-11099基因、ERG10-08536基因、ERG8基因、ERG19基因、IDI基因、ERG12基因均采用CRISPR/Cas9操作系统敲入解脂耶氏酵母Po1f。


3.一种用于基因敲入的解脂耶氏酵母基因工程菌的敲入质粒对，其特征在于，所述敲入质粒对为用于在解脂耶氏酵母中进行基因敲入的基于CRISPR/Cas9系统的质粒对，所述敲入质粒对为pHR_POX2_hrGFP和pCRISPRyl_POX2，pHR_POX3_hrGFP和pCRISPRyl_POX3，pHR_LIP1_hrGFP和pCRISPRyl_LIP1，pHR_POX4_hrGFP和pCRISPRyl_POX4，pHR_E1_hrGFP和pCRISPRyl_E1，pHR_A1_hrGFP和pCRISPRyl_A1，pHR_B1_hrGFP和pCRISPRyl_B1，pHR_A2_hrGFP和pCRISPRyl_A2，pHR_POX6_hrGFP和pCRISPRyl_POX6，pHR_E2_hrGFP和pCRISPRyl_E2中的至少一对敲入质粒对；
(1)质粒对pHR_POX2_hrGFP和pCRISPRyl_POX2：
所述pCRISPRyl_POX2是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl线性化，并与针对POX2位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接构建获得，其中，针对POX2位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
所述pHR_POX2_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX2-LF/POX2-LR和POX2-RF/POX2-RR通过PCR扩增POX2位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX2；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX2连接，获得pHR_POX2_hrGFP；其中，引物POX2-LF、POX2-LR、POX2-RF和POX2-RR的引物序列分别如SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13和SEQIDNO：14所示；引物对plas-F和plas-Rd引物序列分别如SEQIDNO：53和SEQIDNO：54所示；
(2)质粒对pHR_POX3_hrGFP和pCRISPRyl_POX3：
所述pCRISPRyl_POX3是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对POX3位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接即可获得，其中，针对POX3位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
所述pHR_POX3_hrGFP的构建是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对POX3-LF/POX3-LR和POX3-RF/POX3-RR通过PCR扩增POX3位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_POX3；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限制性内切酶SpeI和AvrII进行双酶切的质粒pHR_POX3连接，获得pHR_POX3_hrGFP；其中，引物POX3-LF、POX3-LR、POX3-RF和POX3-RR的引物序列分别如SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17和SEQIDNO：18所示；
(3)pHR_LIP1_hrGFP和pCRISPRyl_LIP1：
所述pCRISPRyl_LIP1是使用AvrII限制性内切酶将质粒pCRISPRyl进行单酶切线性化，与针对LIP1位点设计的sgRNA片段无缝克隆连接即可获得，其中，针对LIP1位点设计的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；
所述pHR_LIP1_hrGFP是以解脂耶氏酵母的基因组为模板，分别使用引物对LIP1-LF/LIP1-LR和LIP1-RF/LIP1-RR通过PCR扩增LIP1位点sgRNA序列两端各1200bp作为左右同源臂，以质粒pHR_AXP_hrGFP为模板，使用引物对plas-F和plas-R通过PCR扩增得到质粒基本骨架，上述三个片段无缝克隆连接获得质粒pHR_LIP1；将质粒pHR_AXP_hrGFP使用限制性内切酶SpeI和AvrII双酶切获得的hrGFP基因表达盒与同样使用限...

【专利技术属性】
技术研发人员：花强，张鑫锎，韦柳静，汪丹妮，陈骏，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31