一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法技术

本发明专利技术属于菌株筛选鉴定技术领域，公开了一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，包括：获取土壤样品，置于250mL三角瓶中并加入生理盐水，并于摇床中振荡富集培养，获得土壤悬浮液；将土壤悬浮液用无菌水进行梯度稀释，并涂布于PDA分离培养基中培养；随机选取具有典型产单宁酶假丝酵母菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化2～3次；纯化结束后将单菌落接种到富集培养液中培养18h，摇瓶培养72h并测定其酶活性，确定目的菌株；将确定的目的菌株进行初筛、复筛试验，鉴定产单宁酶假丝酵母菌的产酶量，并保存在30％甘油中。本发明专利技术操作简单且效率高，误差小，得到产单宁酶假丝酵母菌应用价值高，具有极高的社会和经济效益。

A screening method of Candida for tannase production

【技术实现步骤摘要】
一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法
本专利技术属于菌株筛选鉴定
，尤其涉及一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法。
技术介绍
目前，单宁酸，是一种多酚类物质，除藻类、地衣及苔藓单宁酸含量低，茶叶、高粱、柿子、橡树、辽东栎、葡萄籽和葡萄皮等植物在未成熟期单宁酸的含量较高。单宁酸具有独特的涩味，能与蛋白质、果胶、生物碱等形成不溶性的复合物。根据单宁酸化学结构和特性的差异，可将其划分为水解单宁酸和缩合单宁酸两大类。水解单宁酸分子中含有酯键，在单宁酶、稀碱或稀酸的作用下可水解成没食子酸或逆没食子酸和葡萄糖。而缩合单宁酸是黄烷醇衍生物，分子中的芳香环通过C-C键连接，因为不具有酯的结构，所以不易被单宁酶水解。但是，现有技术生产的单宁酶产量低，市场价格昂贵。单宁酰基水解酶(E.C.3.1.1.20)，通常被称为单宁酶，是偶然在一个从单宁酸水溶液中合成没食子酸的试验中发现的。单宁酶将单宁酸完全水解为没食子酸和葡萄糖，转化的中间产物是2，3，4，6-四没食子酰葡萄糖和两种单没食子酰葡萄糖。单宁酶在植物、动物和微生物中都有存在，但它主要是利用微生物来生产的，例如细菌、酵母和真菌。由于分离筛选出产生该酶的菌量较少，其产量也偏低，稳定性较差，容易被污染，提取工艺较为复杂等问题，而且产单宁酶酵母菌的文献报道较少，仅有KenjiAoki于1976年从假丝酵母菌的培养液中纯化过单宁酶，迄今鲜有报到。单宁酶的应用较为广泛，其研究与应用已经深入到食品加工、饲料加工及化妆品生产工艺过程中。然而，现存有的产单宁酶的菌株酶活性低，且单宁酶在整个反应系统中与底物、产物混在一起，难以回收利用，且对其酶学性质、最佳发酵表达和工业大规模生产等因素的了解不足，单宁酶目前在实际应用上有所欠缺。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：(1)现有技术生产的单宁酶产量低，市场价格昂贵；产单宁酶酵母菌的文献报道较少，迄今鲜有报到。(2)现有技术生产得到的菌量较少，其产量也偏低，稳定性较差，容易被污染，提取工艺较为复杂。(3)现存有的产单宁酶的菌株酶活性低，且单宁酶在整个反应系统中与底物、产物混在一起，难以回收利用，且对其酶学性质、最佳发酵表达和工业大规模生产等因素的了解不足，单宁酶目前在实际应用上有所欠缺。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法。本专利技术是这样实现的，一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，所述产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法包括以下步骤：步骤一，配置富集培养基、PDA分离培养基、YPD培养基；获取5.0～7.0g土壤样品，置于250mL的装有45～50mL富集培养基的三角瓶中，加入100mL生理盐水，并于摇床中振荡富集培养，获得土壤悬浮液；步骤二，将配置得到的PDA分离培养基进灭菌，并冷却至40℃左右，倒入无菌培养基中，将步骤一得到的土壤悬浮液用无菌水进行梯度稀释，利用吸管吸取稀释后的土壤悬浊液，滴加到PDA分离培养基中，并利用涂布棒将滴加的土壤悬浊液轻轻涂开，均匀分布于PDA分离培养基中，于25℃培养箱中静置培养3d；步骤三，随机选取具有典型产单宁酶假丝酵母菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化2～3次，转接至YPD培养基斜面于4℃下保存备用；步骤四，纯化结束后将单菌落接种到富集培养液中培养18h，于30～35℃下，按照180～200r/min的频率摇瓶培养72h；取发酵完的发酵液，4000rpm，离心10min，弃去上清液，收集菌体并将其溶于pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，并恢复至原体积，得到粗酶液，并进行酶活性的测定，确定目的菌株；步骤五，将步骤四确定的目的菌株进行初筛、复筛试验，鉴定产单宁酶假丝酵母菌的产酶量，并保存在30％甘油中。进一步，步骤一中，所述富集培养基、PDA分离培养基、YPD培养基配置方法包括：富集培养基：依次装有100ml水的250ml锥形瓶中按照葡萄糖50g/L、尿素1g/L的比例加入葡萄糖，然后向锥形瓶中继续加入酵母膏1.25g以及琼脂粉；将锥形瓶进行加热，边加热边搅拌，冷却后测试培养基碱度，利用1mol/L的氯化钠调节pH值至7.2，121℃下灭菌20min即可；PDA分离培养基：将葡萄糖、蛋白胨、琼脂、酵母膏以及硫酸镁于115℃下灭菌20分钟；将单宁酸以及溴酚蓝于115℃下灭菌20分钟；然后自然冷却至45℃时，将二者进行混合即可；YPD培养基：将蛋白胨、酵母膏于高压121℃下灭菌20min；加入100ml灭菌后的葡萄糖溶液即可。进一步，步骤一中，所述震荡富集培养的温度为30～35℃，时间为24～28h，震荡频率为180～200r/min。进一步，步骤三中，所述产单宁酶假丝酵母菌菌落的分离纯化方法为：(1)吸取1.0mL富集液，10倍梯度稀释至适当浓度后，涂布于平板鉴别培养基上，于培养箱中30～35℃恒温培养3～4d；(2)挑取单一菌落于鉴别培养基上划线纯化，30～40℃恒温培养3～4d，连传5代培养；(3)由变色圈的颜色深浅和直径大小可知单宁酶含量的高低，选出酶活性较稳定的菌株，保存备用。进一步，步骤三中，所述分离纯化后的产单宁酶假丝酵母菌的保存方法为：选出酶活性较稳定的产单宁酶假丝酵母菌菌株，转接至斜面培养基，并于40～45℃，150～170rmp/min培养3～4d，保存于3～5℃冰箱备用。进一步，步骤四中，所述酶活性测定方法包括：1)取7支洁净的具塞试管，空白管1支，对照管和测试管各3支，将浓度为0.005moI/L的没食子酸丙酯溶液和粗酶液在反应开始前放入40℃水浴中保温5-10min；2)在所有试管中都加入0.25mL没食子酸丙酯溶液，接着将0.25mLpH5.0、0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液加到空白管，0.25mL粗酶液加到测试管，将所有试管都放到40℃水浴保温5min；3)向所有试管中分别加入0.3mL浓度为0.05mol/L甲醇罗丹宁溶液，于40℃水浴保温5min；4)于对照管中0.25ml的粗酶液；并向对照管和测试管中加入浓度为0.5mol/L的KOH溶液0.2mL；于40℃水浴保温5min；5)向所有试管中加入4mL蒸馏水稀释，40℃水浴保温5min；6)通过紫外分光光度计520nm处用蒸馏水做空白，测定反应混合物的吸光值；所有处理试管设置3个重复，取3个重复的平均值。进一步，步骤五中，所述目的菌株的初筛方法为：挑取一环目的菌株接种于鉴别培养基上，在25～30℃培养箱中静置培养24～28h；如果菌株产单宁酶就会水解培养基中的单宁酸产生没食子酸，使培养基中的溴酚蓝指示剂由蓝紫色变为黄色，在菌落周围形成明显的变色圈，保留产生变色圈的菌株。进一步，所述溴甲酚绿培养基，所含组分为：PDA基础培养基，0.01％单宁酸指示剂，0.015％溴酚蓝指示剂，pH6.0。进一步，步骤五中，所述目的菌株的复筛试验，包括：将初筛的目的菌株和工业本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，所述产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法包括以下步骤：/n步骤一，配置富集培养基、PDA分离培养基、YPD培养基；获取5.0～7.0g土壤样品，置于250mL的装有45～50mL富集培养基的三角瓶中，加入100mL生理盐水，并于摇床中振荡富集培养，获得土壤悬浮液；/n步骤二，将配置得到的PDA分离培养基进灭菌，并冷却至40℃左右，倒入无菌培养基中，将步骤一得到的土壤悬浮液用无菌水进行梯度稀释，利用吸管吸取稀释后的土壤悬浊液，滴加到PDA分离培养基中，并利用涂布棒将滴加的土壤悬浊液轻轻涂开，均匀分布于PDA分离培养基中，于25℃培养箱中静置培养3d；/n步骤三，随机选取具有典型产单宁酶假丝酵母菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化2～3次，转接至YPD培养基斜面于4℃下保存备用；/n步骤四，纯化结束后将单菌落接种到富集培养液中培养18h，于30～35℃下，按照180～200r/min的频率摇瓶培养72h；取发酵完的发酵液，4000rpm，离心10min，弃去上清液，收集菌体并将其溶于pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，并恢复至原体积，得到粗酶液，并进行酶活性的测定，确定目的菌株；/n步骤五，将步骤四确定的目的菌株进行初筛、复筛试验，鉴定产单宁酶假丝酵母菌的产酶量，并保存在30％甘油中。/n...

【技术特征摘要】
1.一种产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，所述产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法包括以下步骤：
步骤一，配置富集培养基、PDA分离培养基、YPD培养基；获取5.0～7.0g土壤样品，置于250mL的装有45～50mL富集培养基的三角瓶中，加入100mL生理盐水，并于摇床中振荡富集培养，获得土壤悬浮液；
步骤二，将配置得到的PDA分离培养基进灭菌，并冷却至40℃左右，倒入无菌培养基中，将步骤一得到的土壤悬浮液用无菌水进行梯度稀释，利用吸管吸取稀释后的土壤悬浊液，滴加到PDA分离培养基中，并利用涂布棒将滴加的土壤悬浊液轻轻涂开，均匀分布于PDA分离培养基中，于25℃培养箱中静置培养3d；
步骤三，随机选取具有典型产单宁酶假丝酵母菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化2～3次，转接至YPD培养基斜面于4℃下保存备用；
步骤四，纯化结束后将单菌落接种到富集培养液中培养18h，于30～35℃下，按照180～200r/min的频率摇瓶培养72h；取发酵完的发酵液，4000rpm，离心10min，弃去上清液，收集菌体并将其溶于pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，并恢复至原体积，得到粗酶液，并进行酶活性的测定，确定目的菌株；
步骤五，将步骤四确定的目的菌株进行初筛、复筛试验，鉴定产单宁酶假丝酵母菌的产酶量，并保存在30％甘油中。


2.如权利要求1所述的产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，步骤一中，所述富集培养基、PDA分离培养基、YPD培养基配置方法包括：
富集培养基：依次装有100ml水的250ml锥形瓶中按照葡萄糖50g/L、尿素1g/L的比例加入葡萄糖，然后向锥形瓶中继续加入酵母膏1.25g以及琼脂粉；将锥形瓶进行加热，边加热边搅拌，冷却后测试培养基碱度，利用1mol/L的氯化钠调节pH值至7.2，121℃下灭菌20min即可；
PDA分离培养基：将葡萄糖、蛋白胨、琼脂、酵母膏以及硫酸镁于115℃下灭菌20分钟；将单宁酸以及溴酚蓝于115℃下灭菌20分钟；然后自然冷却至45℃时，将二者进行混合即可；
YPD培养基：将蛋白胨、酵母膏于高压121℃下灭菌20min；加入100ml灭菌后的葡萄糖溶液即可。


3.如权利要求1所述的产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，步骤一中，所述震荡富集培养的温度为30～35℃，时间为24～28h，震荡频率为180～200r/min。


4.如权利要求1所述的产单宁酶假丝酵母菌的筛选方法，其特征在于，步骤三中，所述产单宁酶假丝酵母菌菌落的分离纯化方法为：
(1)吸取1.0mL富集液，10倍梯度稀释至适当浓度后，涂布于平板鉴别培养基上，于培养箱中30～35℃恒温培养3～4d；
(2)挑取单一菌落于鉴别培养基上划线纯化，30～40℃恒温培养3～4d，连传5代培养；
(3)由变色圈的颜色深浅和直径大小可知单宁酶含量的高低，选出酶活性较稳定的菌株，保存备用。


5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈忠洪，陈华维，曾宪为，
申请(专利权)人：玉林市容县奇昌种猪养殖有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45