一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株、筛选方法及用途技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，公开了一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株、筛选方法及用途，所述副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法包括：将待筛乳杆菌选菌株放入盛有初筛培养基的培养皿中恒温培养，将初筛后得到的乳杆菌接种至新鲜牛奶中发酵培养，获取发酵组合物；进行抑菌活性检测；将通过活性检测的单菌落分别置于初筛培养基和厌氧培养基中继续培养，即可得到具有良好抗菌活性的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX‑6‑1菌株。本发明专利技术提供的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法简单可行，操作成本低，能够获得广谱高效的新型抗菌物质，推动其开发和应用，具有广阔的市场。

【技术实现步骤摘要】
一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株、筛选方法及用途
本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株、筛选方法及用途。
技术介绍
目前，在加工、贮藏、运输及消费过程中，导致食品腐败变质的原因较多，有物理因素、化学因素和生物性因素，其中由微生物污染所引起的食品腐败变质是最为重要和普遍的。微生物滋生导致食品腐败变质的同时，也给食品安全带来严重危害。虽然传统的加热杀菌可以有效抑制微生物的污染，但在杀菌的同时也不同程度的破坏了食品的营养、质地以及色香味型，同时产生大量能耗。在现代食品工业中，食品防腐剂被广泛应用于延长食品的保藏期，已成为现代食品生产中一种不可缺少的食品添加剂。而在现代食品工业以及种植、养殖业中，化学防腐剂、杀虫剂及抗生素的不规范使用及残留隐患已越来越引起消费者关注，人们更倾向于消费天然来源的食品资源。副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，兼性厌氧、不运动、无芽孢的杆菌或长杆菌，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性。副干酪乳杆菌广泛存在于传统发酵乳制品和人体胃肠道中，具有调节肠道菌群平衡、增强免疫功能、预防疾病等生理功能。而现有副干酪乳杆菌的筛选方法尚未见报道。因此，针对食品工业中化学防腐剂存在的问题以及对广谱高效天然防腐保鲜剂的需求状况，亟需一种从待筛选菌液中分离筛选具有抗菌活性的副干酪乳杆菌菌株的方法。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有副干酪乳杆菌的筛选方法尚未见报道；同时，食品工业中广泛存在化学防腐剂的问题，亟需广谱高效天然防腐保鲜剂。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株、筛选方法及用途。本专利技术是这样实现的，一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，所述副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法包括以下步骤：步骤一，初筛：将待筛乳杆菌选菌株放入盛有初筛培养基的培养皿中，并将培养皿放入30～35℃的恒温摇床中培养4～5天；步骤二，接种培养：将经过初筛培养后得到的乳杆菌接种至新鲜牛奶中，并置于30～35℃的生化培养箱中发酵培养3～4天，获得发酵组合物；步骤三，活性检测：将发酵组合物挑取划线分离，以大肠杆菌为指示菌，对得到的单菌落进行抑菌活性试验检测；步骤四，将通过活性检测的单菌落放至初筛培养基中，摇床培养8～10天；取2ml培养后的菌液置于放有厌氧培养基的厌氧瓶中培养25～30天；步骤五，将厌氧瓶放至30℃厌氧培养罐中培养20天，在培养的过程中持续充入氮气，得到具有良好抗菌活性的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株。进一步，步骤一中，所述初筛培养基的制备方法为：(1)按质量份数将Na2S2O310～15份、KNO38～12份、(NH4)2HPO45～7份、半胱氨酸1～2份进行混合，得到混合液；(2)在混合液中加入5％碱性复红乙醇溶液，调节pH值为7.2-7.4；(3)设定加热温度为120～125℃，加热时间为15～20min灭菌；(4)在室温下进行冷却，然后加入维生素营养液15～20份，搅拌均匀，得到初筛培养基。进一步，所述维生素营养液中硫胺素为0.12～0.15μg/L、吡哆醇为0.13～0.16μg/L、泛酸钙为0.15～0.2μg/L、硫酸锌3～5mg/L和烟酸为0.11～0.13μg/L。进一步，步骤一中，所述恒温摇床的转速为180～190rpm/min。进一步，步骤三中，对得到的单菌落进行抑菌活性试验检测包括：(1)使用Φ90的平板配制培养基25ml，琼脂的加量为0.75％；(2)对培养基进行120-150℃灭菌5min，放到50℃恒温水浴锅中，降温至50℃；(3)加入大肠杆菌，混匀后倒平板；(4)培养基凝固后用6mm的打孔器打孔，将标样和检测的样品分别加入到不同的孔内；(5)低温扩散3-8小时后，正放培养箱内培养，根据抑菌圈的直径进行抑菌活性计算。进一步，步骤四中，所述摇床培养的温度为30～35℃、摇床转速为180～185转/min。进一步，步骤四中，所述厌氧培养基按质量份数由15～17份MnSO4、10～12份Na2S2O3、5～8份KH2HPO4、3～5份NH4Cl、1.5～2份CaCl2和0.5～1份FeCl3混合后煮沸晾凉，调pH至中性，然后加1～1.2ml指示剂，充N2装瓶，经过120～125℃，20～25min的灭菌得到。进一步，所述指示剂为美兰厌氧指示剂。本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法筛选得到的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株，所述副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株FX-6-1，于2014年02月23日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2014043。本专利技术的另一目的在于提供一种所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株在制备抗菌药物方面的应用。结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：本专利技术提供的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法简单可行，操作成本低，能够获得广谱高效的新型抗菌物质，推动其开发和应用，具有广阔的市场。本专利技术筛选得到的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株发酵产生的抑菌组合物性质稳定、抗菌谱宽，既可以抑制细菌中的革兰氏阳性菌和阴性菌，同时对部分霉菌也有抑制作用。附图说明图1是本专利技术实施例提供的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的初筛培养基的制备方法的流程图。图3是本专利技术实施例提供的对得到的单菌落进行抑菌活性试验检测的流程图。图4～图5是本专利技术实施例提供的筛选分离得到的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1的菌落形态示意图。图6～图7是本专利技术实施例提供的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株在显微镜油镜下观察得到的形态特征示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株、筛选方法及用途，下面结合附图对本专利技术作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法包括以下步骤：S101，初筛：将待筛乳杆菌选菌株放入盛有初筛培养基的培养皿中，并将培养皿放入30～35℃的恒温摇床中培养4～5天；S102，接种培养：将经过初筛培养后得到的乳杆菌接种至新鲜牛奶中，并置于30～35℃的生化培养箱中发酵培养3～4天，获得发酵组合物；S103，活性检测：将发酵组合物挑取划线分离，以大肠杆菌为指示菌，对得到的单菌落进行抑菌活性试验检测；S104，将通过活性检测的单菌落放至初筛培养基中，摇床培养8～10天；取2ml培养后的菌液置于放有厌氧培养基的厌氧瓶中培养25～30天；S105，将厌氧瓶放至30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，所述副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法包括以下步骤：/n步骤一，初筛：将待筛乳杆菌选菌株放入盛有初筛培养基的培养皿中，并将培养皿放入30～35℃的恒温摇床中培养4～5天；/n步骤二，接种培养：将经过初筛培养后得到的乳杆菌接种至新鲜牛奶中，并置于30～35℃的生化培养箱中发酵培养3～4天，获得发酵组合物；/n步骤三，活性检测：将发酵组合物挑取划线分离，以大肠杆菌为指示菌，对得到的单菌落进行抑菌活性试验检测；/n步骤四，将通过活性检测的单菌落放至初筛培养基中，摇床培养8～10天；取2ml培养后的菌液置于放有厌氧培养基的厌氧瓶中培养25～30天；/n步骤五，将厌氧瓶放至30℃厌氧培养罐中培养20天，在培养的过程中持续充入氮气，得到具有良好抗菌活性的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株。/n

【技术特征摘要】
1.一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，所述副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法包括以下步骤：
步骤一，初筛：将待筛乳杆菌选菌株放入盛有初筛培养基的培养皿中，并将培养皿放入30～35℃的恒温摇床中培养4～5天；
步骤二，接种培养：将经过初筛培养后得到的乳杆菌接种至新鲜牛奶中，并置于30～35℃的生化培养箱中发酵培养3～4天，获得发酵组合物；
步骤三，活性检测：将发酵组合物挑取划线分离，以大肠杆菌为指示菌，对得到的单菌落进行抑菌活性试验检测；
步骤四，将通过活性检测的单菌落放至初筛培养基中，摇床培养8～10天；取2ml培养后的菌液置于放有厌氧培养基的厌氧瓶中培养25～30天；
步骤五，将厌氧瓶放至30℃厌氧培养罐中培养20天，在培养的过程中持续充入氮气，得到具有良好抗菌活性的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株。


2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，步骤一中，所述初筛培养基的制备方法为：
(1)按质量份数将Na2S2O310～15份、KNO38～12份、(NH4)2HPO45～7份、半胱氨酸1～2份进行混合，得到混合液；
(2)在混合液中加入5％碱性复红乙醇溶液，调节pH值为7.2-7.4；
(3)设定加热温度为120～125℃，加热时间为15～20min灭菌；
(4)在室温下进行冷却，然后加入维生素营养液15～20份，搅拌均匀，得到初筛培养基。


3.如权利要求2所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，所述维生素营养液中硫胺素为0.12～0.15μg/L、吡哆醇为0.13～0.16μg/L、泛酸钙为0.15～0.2μg/L、硫酸锌3～5mg/L和烟酸为0.11～0.13μg/L。


4.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，步骤一中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈忠洪，陈华维，曾宪为，
申请(专利权)人：玉林市容县奇昌种猪养殖有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45