【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程及基因工程，具体涉及一种羧酸还原酶突变体及其应用。
技术介绍
1、传统化学法催化羧酸到醛的还原反应，不仅需要贵金属作为催化剂，而且存在反应条件苛刻、对相邻官能团的耐受性差、产生副反应等缺点。羧酸还原酶(carboxylic acidreductase,car,ec 1.2.1.30和ec 1.2.1.31)是一类广泛分布于细菌、真菌等生物内的多功能酶，其在结构域上可分为腺苷化结构域，硫脂化结构域和还原结构域，行使着腺苷化，硫脂化，域间传输和还原功能。羧酸还原酶具有反应条件温和、官能团特异性强、底物谱宽等优势，可以解决化学合成法产生的环保压力和能源问题，显著降低生产过程中的资源与能源消耗。
2、不同来源的羧酸还原酶对芳香族酸和中长链脂肪酸的催化效率较高，但是对短链脂肪酸(琥珀酸、乳酸等)的催化效率很低，在一定程度上限制其更广泛的应用。随着人们对羧酸还原酶结构、功能和作用机理的认识不断深入以及高通量筛选技术的不断发展，通过定向进化、半理性和理性设计改造羧酸还原酶的研究快速发展。fedorchuk等通过半理性设计方法对mycobacteroides abscessus来源的羧酸还原酶进行突变，最终得到l284w和t285w两个突变，突变体相较于野生型酶对琥珀酸盐活性增加两倍(fedorchuk tp,khusnutdinova an,flick r,et al.site-directed mutagenesis and stability of thecarboxylic acid reductase
3、另外羧酸还原酶还可与醇脱氢酶等酶进行级联催化羧酸生成醇类等高附加值的下游化合物，可用于添加剂、清洁能源、精细化工及生物医药等领域。具有重要的研究意义及广阔的市场应用前景。因此，筛选并改造能够高效转化2,4-二羟基丁酸合成2,4-二羟基丁醛的羧酸还原酶，对于生物催化合成多官能团短链脂肪醛具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术为了提高羧酸还原酶对短链脂肪酸2,4-二羟基丁酸的催化活性。
2、本专利技术提供一种羧酸还原酶突变体，所述突变体是以氨基酸序列如seq id no.13所示的羧酸还原酶为出发序列，对第259、284、511位中的至少一个氨基酸突变获得的。
3、进一步地限定，所述突变体为以下(a)～(c)中的任意一种或多种：
4、(a)将seq id no.13所示氨基酸序列中的第259位丝氨酸替换为色氨酸；
5、(b)将seq id no.13所示氨基酸序列中的第284位亮氨酸替换为色氨酸；
6、(c)将seq id no.13所示氨基酸序列中的第511位缬氨酸替换为谷氨酸。
7、本专利技术提供编码上述突变体的基因。
8、本专利技术提供一种重组载体，所述重组载体携带上述的编码基因。
9、进一步地限定，所述重组载体的出发载体为pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppic3k或ppic9k系列中的任意一种。
10、本专利技术提供一种重组微生物细胞，携带上述的基因或者表达上述的突变体。
11、进一步地限定，所述微生物细胞为原核微生物细胞或者真核微生物细胞。
12、本专利技术提供上述的突变体、上述的编码基因、上述的重组载体在催化2,4-二羟基丁酸中的应用。
13、本专利技术提供一种合成1,2,4-丁三醇的方法，所述方法是上述的突变体和醇脱氢酶加入到2,4-二羟基丁酸的水溶液中，在30℃条件下反应至少12小时。
14、本专利技术提供一种提高催化2,4-二羟基丁酸催化活性的方法，所述方法是利用上述的突变体加入到2,4-二羟基丁酸的水溶液中，在30℃条件下反应至少12小时。
15、有益效果：本专利技术以来源于mycobacteroides abscessus的羧酸还原酶mabcar为基础，通过半理性设计对应突变位点，通过定点突变技术改造羧酸还原酶分子结构获得三个羧酸还原酶突变体mabcar-s259w、mabcar-l284w和mabcar-v511e，对几个突变体进行酶活评价，相较于野生型羧酸还原酶，三者催化2,4-二羟基丁酸的活性分别提高了50％、30％和240％。本专利技术提高了羧酸还原酶催化2,4-二羟基丁酸的活性，为羧酸还原酶改造进而提高催化短链脂肪酸提供了一条新的思路，并且实现羧酸还原酶与醇脱氢酶级联催化2,4-二羟基丁酸合成1,2,4-丁三醇。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种羧酸还原酶突变体，其特征在于，所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的羧酸还原酶为出发序列，对第259、284、511位中的至少一个氨基酸突变获得的。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)～(c)中的任意一种或多种：
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求3所述的编码基因。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。
6.一种重组微生物细胞，其特征在于，携带权利要求3所述的基因或者表达权利要求1或2所述的突变体。
7.根据权利要求6所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核微生物细胞或者真核微生物细胞。
8.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的编码基因、权利要求4或5所述的重组载体、6或7所述的重组微生物细胞在催化2,4-二
9.一种合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1或2所述的突变体和醇脱氢酶加入到2,4-二羟基丁酸的水溶液中，在30℃条件下反应至少12小时。
10.一种提高催化2,4-二羟基丁酸催化活性的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1或2所述的突变体加入到2,4-二羟基丁酸的水溶液中，在30℃条件下反应至少12小时。
...【技术特征摘要】
1.一种羧酸还原酶突变体，其特征在于，所述突变体是以氨基酸序列如seq id no.13所示的羧酸还原酶为出发序列，对第259、284、511位中的至少一个氨基酸突变获得的。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)～(c)中的任意一种或多种：
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求3所述的编码基因。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发载体为pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppic3k或ppic9k系列中的任意一种。
6.一种重组微生物细胞，其特征在于，携带权利要求3所...
【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，张汝兵，马翔宇，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。