【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物领域和分子生物学领域，特别涉及通过微生物发酵与细胞外酶催化相结合生产血红素的方法，以及其中所使用的重组菌及其制备方法。
技术介绍
1、血红素作为一种卟啉类高附加值产品，在食品和健康领域具有良好的应用前景。传统的血红素合成以化学法或动植物组织提取法为主，存在费时、效率低、环境污染等问题。目前工业中生产血红素多以微生物细胞工厂技术为主，通过底盘生物(例如工业类球红细菌等)进行目标物质合成。但是未经改造的底盘生物存在许多干扰因素，诸如副产物较多、产量较低等，无法实现血红素的高产。因此，为了适应工业化生产的需要，如何通过微生物学及分子生物学提供更高效地的血红素生产技术是亟待解决的关键问题。
技术实现思路
1、为此，本专利技术提出了微生物发酵生产血红素前体与细胞外酶催化相结合的合成思路，从而实现了血红素的高产。在本专利技术的方法中，微生物发酵实现了血红素前体(如粪卟啉iii、铁粪卟啉等)的高效生产以及外排，细胞外酶催化将微生物所生产的血红素前体高效地转化为血红素，从而实现了非化学法体外合成血红素。
2、在一个方面中，本申请提供了生产血红素的方法，所述方法包括：微生物发酵生产并外排血红素前体，以及细胞外催化所述血红素前体，从而得到血红素。
3、在实施方式中，所述生产血红素的方法包括：对能够生产并外排血红素前体的重组菌进行发酵，以生产并外排所述血红素前体；以及，在任选的粪卟啉亚铁螯合酶(在下文中可称为hemh)和铁粪卟啉脱羧酶(在下文中可称为hemq)
4、在一些实施方式中，所述生产血红素的方法包括：对包含活性或表达水平降低的hemn，以及任选地表达粪卟啉原iii氧化酶(在下文中可称为hemy)和/或hemh的重组菌进行发酵，以生产并外排粪卟啉iii和/或铁粪卟啉；以及，在hemq和任选的hemh存在的情况下，对所述发酵液中的粪卟啉iii和/或铁粪卟啉进行细胞外催化，从而得到血红素。
5、在优选的实施方式中，所述重组菌可表达：hemy和hemh；hemy；hemh。
6、在一些实施方式中，所述重组菌包含经修饰的氧非依赖性卟啉原iii氧化酶(在下文中可称为hemn)，所述修饰包括hemn酶的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失，以使hemn酶的活性或表达水平降低。在一些实施方式中，所述重组菌中的编码hemn的基因(hemn基因)被敲除。
7、在一些实施方式中，本专利技术的重组菌包含经修饰的调节子fnrl，所述修饰包括调节子fnrl的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失，以使调节子fnrl的调控能力或表达水平降低。在一些实施方式中，所述重组菌中的编码调节子fnrl的基因被敲除。
8、在一些实施方式中，所述生产血红素的方法包括：对表达hemy和hemh的重组菌进行发酵，以生产并外排粪卟啉iii和/或铁粪卟啉；以及，在hemq和任选的hemh存在的情况下，对所述发酵液中的粪卟啉iii和/或铁粪卟啉进行细胞外催化，从而得到血红素。
9、在具体的实施方式中，所述重组菌的出发菌株可选自光合细菌，包括野生型光合细菌，或其人工诱变的突变株，或经遗传工程化处理的工程化菌株。例如，所述光合细菌可选自类球红细菌、荚膜红细菌或固氮红细菌。
10、在另一方面，本申请提供了生产血红素前体的重组菌，所述重组菌包含活性或表达水平降低的hemn。在一些实施方式中，所述重组菌还包含hemy和/或hemh，或编码hemy和/或hemh的多核苷酸。
11、其中，所述血红素前体可选自粪卟啉iii和/或铁粪卟啉。
12、在优选的实施方式中，所述重组菌可包含hemy和/或hemh，或者编码上述蛋白的多核苷酸。在一些实施方式中，所述重组菌具有导入的编码hemy和/或hemh的表达盒。
13、在优选的实施方式中，所述重组菌可包含活性或表达水平降低的hemn。在优选实施方式中，所述重组菌具有编码hemn的基因的敲除。
14、在优选的实施方式中，所述重组菌包含调控能力降低的调节子fnrl。例如，所述重组菌具有编码fnrl的基因(fnrl基因)的敲除。
15、在具体的实施方式中，所述重组菌的出发菌株可选自光合细菌，包括野生型光合细菌，或其人工诱变的突变株，或经遗传工程化处理的工程化菌株。所述光合细菌可选自类球红细菌、荚膜红细菌或固氮红细菌。
16、在另一方面中，本专利技术提供了上述所述的重组菌的制备方法，所述方法包括：使hemn活性或表达水平降低，以及任选地向出发菌株中导入编码粪卟啉原iii氧化酶hemy和/或粪卟啉亚铁螯合酶hemh的表达盒。
17、在一些实施方式中，使出发菌株中的氧非依赖性卟啉原iii氧化酶hemn的活性或表达水平降低。
18、在一些实施方式中，使出发菌株中的调节子fnrl的调控能力降低。
19、本专利技术通过体内高产前体与体外酶催化相结合的方式，成功利用微生物生产了血红素，避免了从动植物组织中提纯的传统生产方式，提高了合成血红素的生物安全性，并且有效地降低了成本。相比传统的组织提取与化学法合成等方法，本专利技术所述的方法具有高效、高纯度、高产率等优点，尤其能以克级的水平生产血红素前体以及血红素。
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1.一种生产血红素的方法，所述方法包括：对包含活性或表达水平降低的氧非依赖性卟啉原III氧化酶HemN以及任选地表达粪卟啉原III氧化酶HemY和/或粪卟啉亚铁螯合酶HemH的重组菌进行发酵，以生产并外排粪卟啉III和/或铁粪卟啉；以及，在HemQ和任选的HemH存在的情况下，对所述发酵液中的粪卟啉III和/或铁粪卟啉进行细胞外催化，从而得到血红素。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述重组菌中将HemN完全敲除；
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述重组菌的出发菌株选自光合细菌，包括野生型光合细菌，或其人工诱变的突变株，或经遗传工程化处理的工程化菌株；优选地，所述光合细菌选自类球红细菌、荚膜红细菌或固氮红细菌。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述重组菌的发酵条件为：28-32℃，180rpm-220rpm。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在用所述HemH进行细胞外催化时，需要添加Fe2+离子；优选地，当酶量为20-40μM，Fe2+离子为40-70μM；
6.如权利要求1-5中任一项
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，可直接用所述重组菌的发酵液进行细胞外催化。
8.一种生产血红素前体的重组菌，所述重组菌包含活性或表达水平降低的氧非依赖性卟啉原III氧化酶HemN，以及任选地表达粪卟啉原III氧化酶HemY和/或粪卟啉亚铁螯合酶HemH。
9.如权利要求8所述的重组菌，其中，所述血红素前体选自粪卟啉III和/或铁粪卟啉；
10.一种制备权利要求8或9所述的重组菌的方法，所述方法包括：使HemN活性或表达水平降低，以及任选地向出发菌株中导入编码粪卟啉原III氧化酶HemY和/或粪卟啉亚铁螯合酶HemH的表达盒。
...【技术特征摘要】
1.一种生产血红素的方法，所述方法包括：对包含活性或表达水平降低的氧非依赖性卟啉原iii氧化酶hemn以及任选地表达粪卟啉原iii氧化酶hemy和/或粪卟啉亚铁螯合酶hemh的重组菌进行发酵，以生产并外排粪卟啉iii和/或铁粪卟啉；以及，在hemq和任选的hemh存在的情况下，对所述发酵液中的粪卟啉iii和/或铁粪卟啉进行细胞外催化，从而得到血红素。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述重组菌中将hemn完全敲除；
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述重组菌的出发菌株选自光合细菌，包括野生型光合细菌，或其人工诱变的突变株，或经遗传工程化处理的工程化菌株；优选地，所述光合细菌选自类球红细菌、荚膜红细菌或固氮红细菌。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述重组菌的发酵条件为：28-32℃，180rpm-220rpm。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在用所述hemh进行细胞外催化时，需要添加f...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭高翼，张立新，陈海红，王煌炜，王为善，曹婷，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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