【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种再生试剂、含其的试剂盒及其应用。
技术介绍
1、高通量测序，其中以边合成边测序(缩写sbs)为商业主流，主要利用dna聚合酶及带有可逆终止和荧光标记的核苷酸来进行dna序列的识别，它能一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，具有通量高、检测速度快、灵活多用、成本低等优点。
2、边合成边测序过程中包含荧光标记核苷酸的聚合与荧光基团及dntp阻断基团的去除，其中再生试剂的反应速率及反应完成度对整体测序质量有较大影响。
3、边合成边测序具体为：利用扩增或滚环复制等方式生成大量的dna模板，然后锚定特定的测序引物，并向反应体系中同时添加dna聚合酶和荧光标记的核苷酸；或是向反应体系中同时添加dna聚合酶和荧光标记的核苷酸及没有荧光修饰的核苷酸混合液，这些dntps有阻断基团修饰，因而每次只能添加一个dntp，dna链复制反应就会停止，接着激发荧光信号并进行信号的收集，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dntp阻断基团，以便能进行下一轮的测序反应。
4、这种测序技术对荧光基团及dntp阻断基团的去除效率要求较高，其中去除dntp阻断基团的过程在此称为再生反应过程，在多个拷贝中，一旦出现再生反应不完全，就会造成信号错乱，从而影响测序的准确性和测序读长，这也是目前二代测试面临的关键技术问题之一。随着对测序时间要求更快，通量更大，而再生试剂去除阻断基团的速率及效果仍有限，而荧光基团及dntp阻断基团的去除一旦跟不上测序速度，在多拷贝中出现再生不完全，就会导致信号错乱，从而限制了测序的
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是现有的高通量测序中存在的以下缺陷：①再生反应不完全导致反应滞后；②再生试剂的反应速率及反应完成度低，导致测序质量低。为此，本专利技术提供了一种再生试剂、含其的试剂盒及其应用。本专利技术的再生试剂可以提高切除效率，降低由再生反应不完全导致的反应滞后的现象，进而实现更快的测序速度，提高测序质量，实现更长读长。
2、本专利技术主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
3、本专利技术提供了一种再生试剂，其包括还原剂和缓冲液；所述缓冲液的ph为9-9.5；所述缓冲液中包含缓冲物质，所述缓冲物质的δpka/℃绝对值小于0.032。
4、所述再生试剂中，所述还原剂可为能去除高通量测序过程中dntp阻断基团的还原剂，例如为三(3-羟丙基)膦、二硫苏糖醇和三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐中的一种或多种，再例如为三(3-羟丙基)膦。
5、所述再生试剂中，所述还原剂的浓度可为10mm-30mm，例如20mm。
6、所述再生试剂中，所述缓冲液的ph可为9.1、9.2、9.3、9.4或9.5。
7、所述再生试剂中，所述缓冲液的ph可为9.2-9.3。
8、所述再生试剂中，所述缓冲物质的δpka/℃是指在25℃-70℃范围内δpka的变化。
9、所述再生试剂中，所述缓冲物质的δpka/℃绝对值优选小于0.030，还优选小于0.025。
10、所述再生试剂中，所述缓冲物质选自以下种类中的一种或多种：
11、(1)三羟甲基氨基甲烷-盐酸；
12、(2)2-环己胺基乙磺酸/2-环己胺基乙磺酸钠；
13、(3)3-[n-(1,1-二甲基-2-羟乙基)]氨基-2-羟丙烷磺酸/3-[n-(1,1-二甲基-2-羟乙基)]氨基-2-羟丙烷磺酸钠；
14、(4)3-(环己氨基)-2-羟基-1-丙磺酸/3-(环己氨基)-2-羟基-1-丙磺酸钠；
15、(5)三羟甲基甘氨酸/三羟甲基甘氨酸钠；
16、(6)n,n-二羟乙基甘氨酸/n,n-二羟乙基甘氨酸钠；
17、(7)n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-4-丁磺酸/n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-4-丁磺酸钠；
18、(8)n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸/n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸钠；和
19、(9)nahco3/na2co3；
20、(10)2-环己胺基乙磺酸/2-环己胺基乙磺酸钾；
21、(11)3-[n-(1,1-二甲基-2-羟乙基)]氨基-2-羟丙烷磺酸/3-[n-(1,1-二甲基-2-羟乙基)]氨基-2-羟丙烷磺酸钾；
22、(12)3-(环己氨基)-2-羟基-1-丙磺酸/3-(环己氨基)-2-羟基-1-丙磺酸钾；
23、(13)三羟甲基甘氨酸/三羟甲基甘氨酸钾；
24、(14)n,n-二羟乙基甘氨酸/n,n-二羟乙基甘氨酸钾；
25、(15)n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-4-丁磺酸/n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-4-丁磺酸钾；
26、(16)n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸/n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸钾；和
27、(17)khco3/k2co3。
28、所述再生试剂中，所述缓冲物质可为nahco3/na2co3。
29、所述再生试剂中，所述缓冲物质的浓度可为0.075m-0.3m，例如为0.1m-0.2m。
30、所述再生试剂中，所述缓冲液中，当所述缓冲物质为nahco3/na2co3时，所述nahco3/na2co3的总浓度可为0.05m-0.3m，例如为0.2m；
31、再例如所述nahco3和na2co3的浓度为以下任一方案：
32、方案a、nahco3的浓度为0.134m，na2co3的浓度为0.066m；
33、方案b、nahco3的浓度为0.122m，na2co3的浓度为0.078m；
34、方案c、nahco3的浓度为0.112m，na2co3的浓度为0.088m；和
35、方案d、nahco3的浓度为0.1m，na2co3的浓度为0.1m。
36、所述再生试剂中，所述的还原剂和所述的缓冲液可为单独存在或是二者混合状态；优选为二者混合状态。
37、所述再生试剂中，所述缓冲液还可包含无机盐，例如所述无机盐的阴离子为氯离子，再例如为nacl和/或kcl。
38、所述再生试剂中，所述缓冲液中，所述无机盐的浓度可为0.1m-1.5m，例如为1m。
39、所述再生试剂中，所述缓冲液还可包含非离子型表面活性剂，例如为tween；再例如为tween-20和/或tween-80。
40、所述再生试剂中，所述缓冲液中，所述非离子型表面活性剂的体积分数可为0.01％-0.1％，例如为0.05％。
41、所述再生试剂中，所述缓冲液还可包含水，例如为纯水。
42、所述再生试剂中，所述缓冲液由所述的缓冲物质、所述的无机盐、所述的非离子型表面活性剂和所述的水组成；例如所述缓冲液由nahco3、na2co3、nacl、tween-20和水组成。
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1.一种再生试剂，其包括还原剂和缓冲液；其特征在于，所述缓冲液的pH为9-9.5；所述缓冲液中包含缓冲物质，所述缓冲物质的ΔpKa/℃绝对值小于0.032。
2.如权利要求1所述的再生试剂，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
3.如权利要求1所述的再生试剂，其特征在于，所述缓冲物质选自以下种类中的一种或多种：
4.如权利要求1所述的再生试剂，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
5.如权利要求4所述的再生试剂，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
6.如权利要求1所述的再生试剂，其特征在于，所述缓冲液包含以下组分或由以下组分组成：
7.一种试剂盒，其特征在于，其包含如权利要求1-6任一项所述的再生试剂；所述试剂盒可满足以下条件中的一种或两种：
8.一种缓冲液，其特征在于，其成分和含量如权利要求1-6任一项所述。
9.如权利要求1-6任一项所述的再生试剂或如权利要求7所述的试剂盒在高通量测序中的应用。
10.一种高通量测序的方法，其特征在于，其包括以下步骤
...【技术特征摘要】
1.一种再生试剂，其包括还原剂和缓冲液；其特征在于，所述缓冲液的ph为9-9.5；所述缓冲液中包含缓冲物质，所述缓冲物质的δpka/℃绝对值小于0.032。
2.如权利要求1所述的再生试剂，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
3.如权利要求1所述的再生试剂，其特征在于，所述缓冲物质选自以下种类中的一种或多种：
4.如权利要求1所述的再生试剂，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
5.如权利要求4所述的再生试剂，其特征在于，其满足以下...
【专利技术属性】
技术研发人员：缪海涛，徐崇钧，龚梅花，王静静，李计广，马可心，周爽，罗焕，赵微，龙小娟，周靖尧，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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