【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞分离纯化，具体涉及一种肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法。
技术介绍
1、近年来，随着免疫活性细胞分离方法的进步，肠道黏膜免疫得到越来越多的免疫科学工作者的重视，肠道黏膜免疫的研究已成为免疫学研究热点之一。肠道黏膜免疫系统是潜在病原体、食品以及共生菌的共同入口。肠道黏膜免疫系统长期暴露于复杂的环境中，因此能够对食品和共生菌的刺激产生耐受，同时对病原体的刺激产生免疫反应。肠道黏膜固有层是内含丰富血管、淋巴结的疏松结缔组织，位于肠道肌黏膜和肠道上皮细胞层之间。在小肠，它是形成绒毛的核心，而在结肠，它为腺体的形成提供重要条件。肠道黏膜固有层中富含自然杀伤细胞、调控性t细胞、辅助性t细胞th17类cd4+t细胞、γδt细胞、巨噬细胞以及树突细胞等，参与多种免疫反应。肠道黏膜固有层淋巴细胞(lamina proprialymphocytes，lpl)位于肠道黏膜固有层，内含丰富的t细胞和b细胞。lpl中t细胞以cd4+t细胞占优势，cd8+t细胞较少；而b细胞以免疫球蛋白a分泌细胞为主。肠道黏膜固有层的cd4+t辅助性t细胞2细胞(thelpercell2，th2)可分泌多种细胞因子，如白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10，其免疫应答以th2型为主。在体外，肠道黏膜固有层的t细胞对抗原或t细胞受体刺激反应较差，但能够大量分泌干扰素γ、白细胞介素4及5。
2、目前，关于lpl的研究多集中在其与免疫屏障、免疫耐受、细胞凋亡、细胞因子、趋化因子等之间的关系。因此，分离lpl成为多种研究的重要基础工作。国内外多采用
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有淋巴细胞分离方法中死细胞多、操作复杂、分离纯度低的问题。
2、为此，本专利技术提供了一种肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，包括以下步骤：
3、(1)获取动物肠组织，经清洗、剪切后的肠组织片段置于离心管中，加入分离液，震荡、涡旋后过滤；
4、(2)向经步骤(1)处理的肠组织片中加消化液，震荡、涡旋后过滤，收集滤液，离心弃上清留沉淀；
5、(3)将80％等渗percoll溶液铺于新的离心管底部，用40％等渗percoll溶液重悬步骤(2)得到的沉淀，吹打均匀后铺在80％等渗percoll溶液上，两层液体间有分界；
6、(4)密度梯度离心，吸出两层界面间的不透明细胞层，加入缓冲液，混匀后离心，弃去上清液，得到肠道黏膜固有层淋巴细胞。
7、具体的，上述分离液通过以下方法配制：在无ca2+、mg2+的hanks’s平衡液中加入5％胎牛血清，2mmol/l edta，1mmol/l dtt和10mmol/l hepes。
8、具体的，上述消化液通过以下方法配制：在含ca2+、mg2+的pbs缓冲液中加入5％胎牛血清，1.5g/lⅷ型胶原酶，100ku/lⅰ型dna酶，于37℃下孵育5min。
9、具体的，上述步骤(1)中加入分离液后在37℃、250r/min下震荡15min，然后置于旋涡混合器上涡旋30s。
10、具体的，上述步骤(2)中加入消化液后在37℃、250r/min下震荡45min，然后置于旋涡混合器上涡旋30s。
11、具体的，上述步骤(1)和所述步骤(2)中均通过70μm尼龙滤网过滤。
12、具体的，上述步骤(3)的80％等渗percoll溶液和40％等渗percoll溶液通过以下方法配制：将percoll细胞分离液与10×pbs按9:1的体积比混合配制成100％等渗percoll母液；将100％等渗percoll母液、dmem高糖溶液和胎牛血清分别按体积比8:1:1和4:5:1混合，配制成80％等渗percoll溶液和40％等渗percoll溶液。
13、具体的，上述步骤(4)中在20℃下行零加减速密度梯度离心20min。
14、具体的，上述步骤(4)中缓冲液为不含ca2+、mg2+的pbs缓冲液。
15、具体的，上述步骤(4)中加入缓冲液混匀后，在4℃下，400×离心8min。
16、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：
17、本专利技术提供的这种肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法简单、高效、稳定，能够成功分离出高纯度、高活性的lpl。整个分离过程不超过6h，获取的小鼠lpl细胞活率可达97.4％。分离过程中使用无ca2+、mg2+的hanks’s平衡液和pbs缓冲液，减少对炎症性肠病的病变肠黏膜固有层单核细胞的抑制性，获得的lpl细胞数量显著提升。此外，采用本专利技术提供的分离液、消化液和percoll溶液以及处理温度、时间、离心条件等，可提高分离效果。
18、以下将结合附图对本专利技术做进一步详细说明。
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1.一种肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于，所述分离液通过以下方法配制：在无Ca2+、Mg2+的Hanks’s平衡液中加入5％胎牛血清，2mmol/L EDTA，1mmol/L DTT和10mmol/L HEPES。
3.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于，所述消化液通过以下方法配制：在含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液中加入5％胎牛血清，1.5g/LⅧ型胶原酶，100kU/LⅠ型DNA酶，于37℃下孵育5min。
4.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于：所述步骤(1)中加入分离液后在37℃、250r/min下震荡15min，然后置于旋涡混合器上涡旋30s。
5.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于：所述步骤(2)中加入消化液后在37℃、250r/min下震荡45min，然后置于旋涡混合器上涡旋30s。
6.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，
7.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于，所述步骤(3)的80％等渗Percoll溶液和40％等渗Percoll溶液通过以下方法配制：将Percoll细胞分离液与10×PBS按9:1的体积比混合配制成100％等渗Percoll母液；将100％等渗Percoll母液、DMEM高糖溶液和胎牛血清分别按体积比8:1:1和4:5:1混合，配制成80％等渗Percoll溶液和40％等渗Percoll溶液。
8.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于：所述步骤(4)中在20℃下行零加减速密度梯度离心20min。
9.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于：所述步骤(4)中缓冲液为不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液。
10.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于：所述步骤(4)中加入缓冲液混匀后，在4℃下，400×离心8min。
...【技术特征摘要】
1.一种肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于，所述分离液通过以下方法配制：在无ca2+、mg2+的hanks’s平衡液中加入5％胎牛血清，2mmol/l edta，1mmol/l dtt和10mmol/l hepes。
3.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于，所述消化液通过以下方法配制：在含ca2+、mg2+的pbs缓冲液中加入5％胎牛血清，1.5g/lⅷ型胶原酶，100ku/lⅰ型dna酶，于37℃下孵育5min。
4.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于：所述步骤(1)中加入分离液后在37℃、250r/min下震荡15min，然后置于旋涡混合器上涡旋30s。
5.如权利要求1所述的肠道黏膜固有层淋巴细胞分离方法，其特征在于：所述步骤(2)中加入消化液后在37℃、250r/min下震荡45min，然后置于旋涡混合器上涡旋30s。
6.如权利要求1所述的肠道...
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