【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于高通量基因测序领域，具体而言，本专利技术涉及一种检测二代测序(ngs)中探针的捕获效率的方法以及试剂盒。
技术介绍
1、高通量测序技术又称下一代测序技术(ngs)，可以一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定。ngs技术以超高的测序通量、规模和速度革新了生物科学的发展，使科学家得以前所未有的方式进行广泛而深入的生物学系统和应用研究。ngs技术用于确定全基因组或目标区域dna的核苷酸排列顺序。相比于全基因组测序，靶向区域测序仅测定基因组上临床治疗指导相关或感兴趣的区域，更加高效经济，因而在肿瘤用药指导，筛查等应用领域得以普及。
2、聚合酶链式反应(即pcr)是一种广泛运用于分子遗传和诊断的技术，可以分析样品中低浓度的dna序列。
3、探针捕获建库法是指制备带有化学标记的dna或rna寡聚体与目标dna片段进行特异性氢键结合并将结合区域富集的一种建库方法。目标序列捕获是根据目标基因组序列，设计与之完全互补的探针。然后将样本dna片段化，加上用于测序的接头后与探针杂交，洗脱去除未杂交上的dna，回收目标dna片段，再经过pcr扩增后进行dna测序。磁捕法是基于生物素和链霉亲和素的特异结合以及碱基互补原理，将生物素标记的特异寡核苷酸探针与目标序列杂交，再利用生物素与链霉亲和素特异结合，将探针结合至包被链霉亲和素的磁珠上，并利用磁力架收集，经低盐缓冲液洗涤，去除蛋白质、非靶核苷酸等杂质，最终得到纯化的特异性核酸分子。磁捕法中采用的液相杂交的优势在于杂交效率更高，易于操作，时间短，便于自动化操作
4、对于探针捕获法的二代测序(ngs)而言，杂交前后的模板捕获效率是很重要的一个指标。但是这个指标目前没有合适的实验方法来直接测量。现有指标是通过ngs建库后的中靶率(on target rate)来评估探针捕获目标分子的特异性，但是这个指标无法评估杂交前后分子回收率，而分子回收率是杂交捕获试剂盒比较重要的一个性能方面。因此，需要建立一种方法来评估杂交体系的捕获效率，进而优化杂交体系性能。
技术实现思路
1、本申请建立了一种直接测量杂交前后捕获效率(capture efficiency)的方法。该方法的建立能够很好的衡量杂交体系中探针对模板的杂交捕获效率，从而评估杂交体系的性能，以便于对杂交体系进行优化。
2、相对于现有技术的间接或定性检测比如中靶率(on target rate)，本申请首创性地直接定量测量二代测序中探针杂交前后的捕获效率，这将极大有助于杂交方法的比较以及优化。
3、在此基础上，本专利技术提供了一种检测探针的捕获效率的方法；用于检测探针的捕获效率的试剂盒；以及定量pcr反应体系在制备用于所述方法的试剂盒中的用途。
4、在第一方面，提供了一种检测探针的捕获效率的方法，所述方法包括以下步骤：
5、1)使用来源于生物样品的dna构建文库；
6、2)用探针和磁珠捕获文库，且随后不进行扩增；
7、3)将捕获后的文库从结合的磁珠上分离下来；和
8、4)通过定量pcr对捕获前后的文库进行定量，从而得出捕获效率。
9、在一些实施方案中，所述dna为超声打断dna、酶切打断dna或cfdna。
10、在一些实施方案中，所述生物样品为体液样品或组织样品。
11、在一些实施方案中，所述生物样品为石蜡包埋样品，优选ffpe样品。
12、在一些实施方案中，所述磁珠为m270磁珠。
13、在一些实施方案中，步骤3)包括：将捕获后尚未扩增的文库置于92-98 ℃加热3-10 min ，优选95℃加热5min；加热完成后立即置于冰上；然后使用磁力架在冰上分离磁珠，获取上清液作为分离的捕获后的文库。
14、在一些实施方案中，所述步骤4)包括：对于标准品绘制反映dna浓度与ct值关系的标准曲线；然后基于生物样品在捕获前后的ct值确定dna浓度或捕获产量，并依据panel大小和基因组大小，计算捕获效率。
15、在一些实施方案中，如下计算捕获效率：捕获效率=(捕获总量/投入量)/((panel大小/人类基因组大小)/中靶率)，其中投入量是指步骤1)所构建的dna文库的量，捕获总量为步骤3)捕获后从结合的磁珠上分离下来的文库的量。
16、在一些实施方案中，所述定量pcr的反应体系包含：
17、taq聚合酶；
18、缓冲液；
19、引物和探针的混合液；
20、不含核酸酶的水；和
21、dna模板。
22、在第二方面，提供了一种用于检测探针的捕获效率的试剂盒，所述试剂盒包含定量pcr反应体系和使用说明，其中所述定量pcr反应体系包含：
23、taq聚合酶；
24、缓冲液；
25、引物和探针的混合液；
26、不含核酸酶的水；和
27、dna模板。
28、在第三方面，提供了一种定量pcr反应体系在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于第一方面所述的方法中，所述反应体系包含：
29、taq聚合酶；
30、缓冲液；
31、引物和探针的混合液；
32、不含核酸酶的水；和
33、dna模板。
34、下列描述和实施例详细阐述了本专利技术的实施方案。要理解的是，本专利技术不限于本文所述的具体实施方案并因此可改动。本领域技术人员将认识的是，存在本专利技术的许多变动和修改，所述变动和修改均包含在其范围之内。
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1.一种检测探针的捕获效率的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA为超声打断DNA、酶切打断DNA或cfDNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品为体液样品或组织样品。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品为石蜡包埋样品，优选FFPE样品。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述磁珠为M270磁珠。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤3)包括：将捕获后尚未扩增的文库置于92-98℃加热3-10min；加热完成后立即置于冰上；然后使用磁力架在冰上分离磁珠，获取上清液作为分离的捕获后的文库。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤4)包括：对于标准品绘制反映DNA浓度与Ct值关系的标准曲线；然后基于生物样品在捕获前后的Ct值确定DNA浓度或捕获产量，并依据panel大小和基因组大小，计算捕获效率。
8.根据权利要求7所述的方法，其中如下计算捕获效率：捕获效率=(捕获总量/投入量)/((panel大小/人类基因组大小)/
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述定量PCR的反应体系包含：
10.一种用于检测探针的捕获效率的试剂盒，所述试剂盒包含定量PCR反应体系和使用说明，其中所述定量PCR反应体系包含：
...【技术特征摘要】
1.一种检测探针的捕获效率的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna为超声打断dna、酶切打断dna或cfdna。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品为体液样品或组织样品。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品为石蜡包埋样品，优选ffpe样品。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述磁珠为m270磁珠。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤3)包括：将捕获后尚未扩增的文库置于92-98℃加热3-10min；加热完成后立即置于冰上；然后使用磁力架在冰上分离磁珠，获取上清液作为分离的捕获后的文库。
7.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈弘远，陈昌岳，张振华，李亚雷，伍欢，谢正华，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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