【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及基于raa-crispr-cas13a检测kpc型碳青霉烯酶基因试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、碳青霉烯类抗菌药物是临床中常用的一类广谱β-内酰胺类抗菌药物，因其抗菌谱广、抗菌作用强，曾被认为是20世纪80年代以来治疗耐多药革兰阴性杆菌严重感染的最后一道防线。近几年来发现，耐受碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌也越来越多，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌等，这类细菌被称为耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌(carbapenem resistant enterobacteriaceae，cre)。近年来，随着临床上对这类药物的不当使用，耐药率逐年上升。目前对碳青霉烯类抗菌药物产生耐药的主要菌群是肠杆菌科细菌，其耐药产生的主要机制为产生了一种可水解碳青霉烯类抗菌药物的水解酶，即碳青霉烯酶(carbapenemase)。且碳青霉烯酶基因可以通过质粒和转座子在细菌之间进行水平传播，造成碳青霉烯酶的流行。根据ambler分类方法可以将碳青霉烯酶分为三类(a、b和d类)，a类酶主要包括kpc、ges、sme等，b类酶主要包括ndm、imp、vim等，d类酶包括oxa-48等。虽然种类繁多，但在全球范围内主要流行以下5种碳青霉烯酶：kpc(klebsiella pneumoniaecarbapenemase，kpc)、ndm(new delhi metallo-β-lactamases，ndm)、vim(veronaintegron-encoded metallo-β-lactamases，vim)、imp(imi
2、目前实验室常用的碳青霉烯酶检测方法主要为表型检测和基因型检测。常用的表型检测方法有：改良hodge试验、carba-np确证试验、edta双纸片协同试验、carba-np确证试验以及碳青霉烯失活法(cim)试验，但是以上检测方法存在耗时较长的缺点，通常需要24-96小时，并且无法得知具体的碳青霉烯酶基因型。基于抗原抗体反应的商用试纸条虽有便捷的优势，但其达不到理想的灵敏度。常用的碳青霉烯酶基因型检测方法包括作为金标准的传统pcr技术、荧光定量pcr技术、全基因组测序技术等，但这些检测方法需要依赖实验室环境、昂贵的仪器设备，并且成本较高。
3、近些年，研究人员运用crispr-cas13a系统建立了一系列核酸检测平台，用于分子诊断。cas13a效应蛋白是一个rna引导的crispr效应蛋白，它具有“附带切割”特性，不仅能够特异性靶向切割单链rna，而且在切割目标序列后仍保持活性，继续切割其他非目标rna。该技术为快速检测kpc型碳青霉烯酶基因提供了新思路。重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aided amplification，raa)，是一种利用重组酶、单链结合蛋白、dna聚合酶在等温条件37℃下，重组酶与引物形成聚合体扫描双链dna，在与引物同源的序列处使双链dna解旋。在单链结合蛋白(ssb)和dna聚合酶的作用下，使引物和模板之间发生链替换，新的dna片段可以在体外快速地扩增出来。并在单链结合蛋白以及缩合剂聚乙二醇存在的条件下，不断重复这一过程而最终实现核酸的高效扩增。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是如何精准、灵敏、简便、快速地检测kpc型碳青霉烯酶基因和/或如何鉴定产碳青霉烯酶菌株。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于检测kpc型碳青霉烯酶基因的试剂盒，所述试剂盒可包括特异性扩增kpc型碳青霉烯酶基因的引物对和crrna，所述引物对可由引物raa-f2和引物raa-r2组成，所述引物raa-f2可为seq id no.4所示的单链dna分子；所述引物raa-r2可为seq id no.6所示的单链dna分子。
3、进一步地，上述试剂盒中，所述crrna的序列可由用于与cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向kpc型碳青霉烯酶基因靶点序列的向导序列组成，所述向导序列可为seq id no.8的第39-66位(5’-ugccuguugucagauauuuuuccgagau-3’)。
4、所述kpc型碳青霉烯酶基因靶点的核苷酸序列为seq id no.7，位于kpc型碳青霉烯酶基因组(genbank id：ng049253.1)第324-351位。
5、进一步地，上述试剂盒中，所述crrna的核苷酸序列可为seq id no.8。
6、核苷酸序列为seq id no.8的crrna名称可为kpc-crrna-5。
7、其中，seq id no.8的第1-38位为用于与cas13a蛋白结合的锚定序列；seq idno.8的第39-66位为靶向kpc型碳青霉烯酶基因靶点序列(seq id no.7)的向导序列。
8、进一步地，所述试剂盒还可包括cas13a蛋白。
9、上述试剂盒中，所述cas13a蛋白可独立存在或与本专利技术所述的crrna以复合物的形式存在。
10、进一步地，所述cas13a蛋白可为lwcas13a蛋白。
11、进一步地，所述试剂盒还可包括报告rna。
12、所述报告rna可为具有信号报告功能的rna分子，当所述rna分子被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。
13、在本专利技术的一个实施例中，所述报告rna为rnasealerttm qc system v2(invitrogentm公司产品，货号4479769)。
14、进一步地，所述试剂盒还可包括t7 rna聚合酶、ntp(如ntp mix)、rna酶抑制剂、缓冲液(如hepes buffer solution)、mgcl2中的一种或多种。
15、进一步地，所述试剂盒还可包括记载有本文中所述检测kpc型碳青霉烯酶基因的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本专利技术方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、cd等)。
16、所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
17、所述引物对(引物raa-f2和引物raa-r2)也在本专利技术的保护范围内。
18、本专利技术还提供了用于检测kpc型碳青霉烯酶基因的组合物，所述组合物可由所述引物对(引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对和crRNA，所述引物对由引物RAA-F2和引物RAA-R2组成，所述引物RAA-F2为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；所述引物RAA-R2为SEQ ID No.6所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA的序列由用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向KPC型碳青霉烯酶基因靶点序列的向导序列组成，所述向导序列为SEQ ID No.8的第39-66位。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列为SEQ IDNo.8。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas13a蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括报告RNA。
6.权利要求1中所述的引物对。
7.用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的组合物，其特征在于，所述组合物由权利要求6所述的引物对和权利要求2或3中所述的crRNA组成。
8.一种检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas13a检测体系还包括Cas13a蛋白和/或T7 RNA聚合酶。
10.权利要求1中所述的引物对，和/或，权利要求2或3中所述的crRNA，和/或，权利要求7所述组合物的下述任一种应用：
...【技术特征摘要】
1.用于检测kpc型碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对和crrna，所述引物对由引物raa-f2和引物raa-r2组成，所述引物raa-f2为seq id no.4所示的单链dna分子；所述引物raa-r2为seq id no.6所示的单链dna分子。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crrna的序列由用于与cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向kpc型碳青霉烯酶基因靶点序列的向导序列组成，所述向导序列为seq id no.8的第39-66位。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述crrna的核苷酸序列为seq idno.8。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：任锋，张向颖，曹亚玲，徐玲，田原，范子豪，高耀，段钟平，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京佑安医院，
类型：发明
国别省市：
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