本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种包含植酸酶突变体的重组载体或重组菌株。本发明专利技术通过PCR获得来自枯草芽孢杆菌突变菌的耐热植酸酶突变基因A‑2，并将A‑2构建到pPIC9质粒上，得到重组质粒pPIC9‑A‑2，并转化到毕赤酵母GS115，筛选得到高表达耐热植酸酶的重组菌，所表达的耐热植酸酶在80℃保温处理30min，相对活性仍剩余75％左右，90℃处理30min，酶活仍存留25％以上，耐热性良好，可以广泛用于食品、饲料等行业。
【技术实现步骤摘要】
一种包含植酸酶突变体的重组载体或重组菌株的应用本申请是专利技术专利《一种植酸酶突变体及其应用》的分案申请，原案申请日为2017年9月30日，申请号为201710913105X，专利技术名称为《一种植酸酶突变体及其应用》。
：本专利技术涉及生物
，具体涉及一种包含植酸酶突变体的重组载体或重组菌株。
技术介绍
：磷是动物机体必须的矿物元素，植物组织中的磷大部分是以植酸(肌醇六磷酸)或植酸盐的形式存在，肌醇六磷酸分子可以螯合金属离子，以螯合物的形式存在，其溶解度很低，作用相当于抗营养因子，很难被单胃动物吸收，未被充分利用的磷，通过动物排泄物进入水体最终导致水体富营养化。植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸盐的一类酶的总称，在动物饲料中添加植酸酶，可以提高饲料中磷的利用率，减少磷的排出对环境的污染。1996年FDA确认植酸酶在食品中应用是安全的，可在动物饲料中使用，植酸酶已成为第三大饲用酶。可以通过微生物来大量合成植酸酶，添加到饲料中供动物体利用，以解决单胃动物缺乏能够利用植酸盐的植酸酶的问题，但是饲料加工过程中的热处理要求植酸酶有一定耐热性。而目前面临的主要问题是植酸酶高昂生产成本、低植酸酶产率以及耐热性不足。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种耐热性提高的植酸酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。所述植酸酶突变体来自一株经紫外诱变获得的枯草芽孢杆菌BS2，将植酸酶突变体编码基因A-2从BS2中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母GS115中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。在本专利技术中采用如下定义：1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2.植酸酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如Gln166Asn，表示位置166的氨基酸由野生型的Gln替换成Asn，位置的编号对应于SEQIDNo.2中野生型植酸酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于SEQIDNo.1中野生型植酸酶的核苷酸序列编号。在本专利技术中，A-1表示野生型植酸酶的编码基因，A-2表示植酸酶突变体的编码基因，信息如下表。所述植酸酶突变体的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.4所示；所述植酸酶突变编码基因A-2的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示；用于表达所述植酸酶的表达载体为pPIC9，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母GS115；所述毕赤酵母工程菌是将植酸酶突变编码基因A-2连接表达载体pPIC9，并在毕赤酵母GS115中表达所得；本专利技术还提供上述植酸酶突变体在饲料领域的应用。本专利技术的实验步骤具体如下：1、将植酸酶突变体的编码基因A-2进行酶切，连接至表达载体pPIC9，得到重组载体；2、将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到植酸酶突变体的生产菌株GS115/pPIC9-A-2；3、以GS115/pPIC9-A-2为生产菌株发酵生产植酸酶。所述植酸酶突变体的酶学性质如下：(1)pH:pH4-6酶活稳定，最适作用pH5.0。(2)温度：50℃-80℃酶活稳定，最适作用温度为70℃。(3)耐热性：该酶在80℃保温30min酶活仍残留75％以上，90℃保温30min酶活仍存留25％以上。有益效果：1、本专利技术公布了一种全新的植酸酶突变体，该突变体具有酶活高，热稳定性好的特点。该突变体发酵液酶活可达359U/mL，较野生型植酸酶提高200％；2、本专利技术获得的植酸酶在80℃保温30min酶活仍残留75％以上，90℃保温30min酶活仍存留25％以上。附图说明：图1菌落PCR鉴定电泳图；其中，M为marker，泳道1为基因A-2；图2植酸酶最适pH曲线；图3植酸酶最适温度曲线；图4植酸酶温度稳定性曲线。具体实施方式：以下通过具体实施例对本专利技术作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本专利技术实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本专利技术原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本专利技术保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。实施例1植酸酶基因A-2的获得土壤中分离得到一株能产植酸酶的枯草芽孢杆菌BS，经紫外诱变筛选得到一株具有耐热植酸酶活性的菌株BS2，根据其突变基因A-2的序列设计PCR引物，5'端加入酶切位点XhoⅠ，3'端加入酶切位点NotⅠ，通过PCR得到突变体基因A-2，其核苷酸序列为SEQIDNo.3。引物序列如下：A-2-F5'-CCGCTCGAGATGAAGGTTCCAAAAACAAT-3'A-2-R5'-TTGCGGCCGCCTAGCCGTCAGAACGGTCTT-3'实施例2重组载体pPIC9-A-2的构建分别对突变体基因A-2和质粒pPIC9进行XhoⅠ和NotⅠ酶切，回收产物，将回收后的A-2和pPIC9按比例混合，用T4连接酶在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布在LB(含氨苄霉素)固体平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落至LB液体培养基，37℃培养，菌液进行菌落PCR，电泳鉴定结果如图1，测序结果显示序列正确，序列大小1.15kb。抽提重组质粒待用。实施例3重组质粒转化毕赤酵母1.毕赤酵母GS115感受态细胞的制备1)挑取毕赤酵母平板单菌落，接种于5mL的YPD培养基，30℃，220r/min振荡过夜；2)取0.5mL的过夜培养的菌液，接种于50mL新鲜配制的YPD培养基，30℃，220r/min振荡培养，使OD600值达到1.3-1.5；3)取上述培养液于4℃，3000r/min，离心5min；4)弃去上清液，加入50mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；5)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入25mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；6)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入10mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液，重悬菌体；7)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入1mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液(预先加入甘油至终浓度15％)，振荡混匀。8)分装100μL/管至无菌EP罐，-70℃冰箱冰冻保藏(新鲜制备的感受态细胞效果更佳)。2.线性化质粒的转化抽提得到的重组质粒pPIC9-A-2用SalⅠ进行单酶切，得到线性化质粒。取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻。1)将100μL感受态细胞移出本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组载体或重组菌株的应用，其特征在于，所述重组载体或重组菌株包含序列表SEQ ID No.3所示植酸酶突变体编码基因。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组载体或重组菌株的应用，其特征在于，所述重组载体或重组菌株包含序列表SEQIDNo.3所示植酸酶突变体编码基因。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组载体是在表达载体为pPIC9中插入SEQIDNO.3所示的基因所得。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组菌株是在宿主细胞毕赤酵母GS115中表达SEQIDNo.3所示的基因所得。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用于生产植酸酶。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，植酸酶的生产方法，具体如下：
以以pPIC9...
【专利技术属性】
技术研发人员：王兴吉，郭庆文，张杰，盛花开，刘文龙，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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