一种双sgRNA无痕基因编辑质粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种双sgRNA无痕基因编辑质粒及其制备方法和应用，所述质粒包括Cas9蛋白表达框和双sgRNA表达框；所述双sgRNA包括宿主基因编辑sgRNA和质粒基因编辑sgRNA。本发明专利技术设计含有双sgRNA的质粒对宿主进行基因编辑，所述双sgRNA的其中一条sgRNA用于对宿主进行基因编辑，另一条sgRNA用于消除质粒，实现了在对宿主进行基因编辑的同时消除基因编辑质粒的目的，不会因Cas9蛋白的持续表达而提高脱靶率，也不影响后续实验，将该质粒转化入酿酒酵母进行基因编辑，显著提高了酿酒酵母无痕编辑的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种双sgRNA无痕基因编辑质粒及其制备方法和应用
本专利技术属于基因编辑
，涉及一种双sgRNA无痕基因编辑质粒及其制备方法和应用，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas9的双sgRNA无痕基因编辑质粒及其制备方法和在酿酒酵母基因改造、酿酒酵母基因功能研究和菌种改良中的应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9技术一经问世，便成为生物领域的关注焦点。CRISPR/Cas9技术主要包含两个要素：切割DNA双链的Cas9蛋白和识别靶位点的sgRNA。特异性gRNA引导Cas9蛋白对靶位点DNA双链进行切割，造成DNA双链断裂，细胞利用自身的修复机制同源重组系统(HR)和非同源末端连接途径(NHEJ)，对断裂的DNA进行修复，实现基因的敲除或插入，达到基因编辑的目的。CRISPR/Cas9基因编辑技术对酿酒酵母代谢研究具有划时代的意义，可以用于酿酒酵母基因功能研究、代谢通路研究和菌种改良等。对酿酒酵母进行基因编辑，一般是将基因编辑质粒转化入酿酒酵母感受态细胞，转化的质粒永久存在于酿酒酵母中。然而，存在的质粒可能影响后续实验研究，例如，Cas9的持续表达会提高脱靶率，使用含有某种筛选标记的质粒进行基因编辑后，向菌株再次转化含有相同筛选标记的质粒，很难进行阳性克隆的筛选，如果此标记是营养缺陷型标记，还可能影响氨基酸含量的测定。尽管目前已经开发了一些无痕编辑方法，但是仍然存在诸多不足。现有技术通常使用体外转录的gRNA转化酿酒酵母消除质粒，这种方法对体外转录的gRNA质量和转化率要求很高，体外转录的gRNA容易降解，操作困难，耗时耗力耗资，即使成功转化入酿酒酵母，也因其稳定性差而容易在酿酒酵母中失去功能，难以达到消除质粒的目的。CN109722436A公开了基于CRISPR-Cas9的基因组无痕编辑的载体与应用，基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体，结构为同源臂、sgRNA基因、启动子pGAL、Cas9、正向筛选标记、原核生物的复制起始位点六个组件顺次连接组成环形载体，所构建质粒中的Cas9基因具有作为基因编辑和反向筛选标记的双重功能，因而Cas9经诱导发挥作用时，Cas9蛋白即会识别基因组上的靶向基因，也会识别载体中的同源臂基因，进而在实现靶向基因编辑的同时，亦可以将整个载体从目标菌株中进行切除，达到无痕敲除的目的。然而，该环形载体结构复杂、组件众多，存在无法高效转染入宿主细胞的问题。CN110628798A公开了枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统，该系统的构建方法为：1)构建质粒pBSCas9；2)构建质粒pDonor；3)构建多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG；4)由pBSCas9，pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统，但是该基因编辑系统存在众多质粒，存在无法高效转染入宿主细胞的问题。因此，有必要对现有的无痕编辑技术进行改进。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种双sgRNA无痕基因编辑质粒及其制备方法和应用，所述双sgRNA无痕基因编辑质粒可以在进行基因编辑的同时消除该基因编辑质粒，不会因Cas9蛋白的持续表达而提高脱靶率，也不影响后续实验，将该质粒转化入酿酒酵母进行基因编辑，显著提高了酿酒酵母无痕编辑的效率。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种双sgRNA无痕基因编辑质粒，所述质粒包括Cas9蛋白表达框和双sgRNA表达框；所述双sgRNA包括宿主基因编辑sgRNA和质粒基因编辑sgRNA。本专利技术中，设计含有双sgRNA的质粒对宿主进行基因编辑，所述双sgRNA的其中一条sgRNA用于对宿主进行基因编辑，另一条sgRNA用于消除质粒，实现了在对宿主进行基因编辑的同时消除基因编辑质粒的目的，解决了Cas9蛋白持续表达而提高脱靶率和影响后续实验的问题。优选地，所述Cas9蛋白表达框包括启动子、Cas9蛋白编码序列、核定位信号编码序列和终止子。优选地，所述启动子包括TEF1，Cas9蛋白编码序列为经过酿酒酵母密码子优化后的序列。优选地，所述核定位信号包括SV40核定位信号。优选地，所述终止子包括CYC1。优选地，所述双sgRNA表达框包括启动子、双sgRNA编码序列、酶切位点编码序列和终止子。优选地，所述双sgRNA表达框包括启动子、酶切位点编码序列、宿主基因编辑sgRNA、酶切位点编码序列、质粒基因编辑sgRNA和终止子。优选地，所述双sgRNA表达框包括启动子、酶切位点编码序列、宿主基因编辑sgRNA、酶切位点编码序列、Cas9蛋白编辑sgRNA和终止子。优选地，所述启动子包括SNR52。优选地，所述酶切位点包括BamH1识别位点和/或Pac1识别位点。优选地，所述质粒还包括复制起点和/或抗筛选标记编码序列。优选地，所述筛选标记包括氨苄青霉素和/或遗传霉素，其中，氨苄青霉素(Amp)为大肠杆菌筛选标记，遗传霉素(G418)为酿酒酵母筛选标记第二方面，本专利技术提供了一种制备第一方面所述的质粒的试剂盒，所述试剂盒包括用于合成宿主基因编辑sgRNA的编码序列的引物对、和用于合成质粒基因编辑sgRNA的编码序列的引物对，所述引物对的两端添加有同源臂。优选地，所述引物的长度为55～70bp，例如可以是55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp或70bp，优选为60～65bp。优选地，所述同源臂的长度为35～50bp，例如可以是35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp或50bp，优选为40～45bp。优选地，所述试剂盒还包括含有Cas9蛋白表达框的表达载体。优选地，所述表达载体为有利于酿酒酵母基因编辑的双sgRNA表达载体，例如可以是pDuRCC-K，所述pDuRCC-K中插入用于基因编辑的sgRNA1和针对自身质粒序列的sgRNA2。优选地，所述试剂盒还包括限制性内切酶、DNA聚合酶或重组酶中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述限制性内切酶包括BamH1和Pac1。优选地，所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶。优选地，所述重组酶包括T5核酸外切酶和高保真Taq酶。优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、重组缓冲液或酶切缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。第三方面，本专利技术提供了一种第二方面所述的试剂盒制备双sgRNA无痕基因编辑质粒的方法，所述方法包括：(1)设计用于合成宿主基因编辑sgRNA的编码序列的引物对、和用于合成质粒基因编辑sgRNA的编码序列的引物对，所述引物对的两端添加有同源臂，利用PCR构建宿主基因编辑sgRNA的编码序列和质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双sgRNA无痕基因编辑质粒，其特征在于，所述质粒包括Cas9蛋白表达框和双sgRNA表达框；/n所述双sgRNA包括宿主基因编辑sgRNA和质粒基因编辑sgRNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种双sgRNA无痕基因编辑质粒，其特征在于，所述质粒包括Cas9蛋白表达框和双sgRNA表达框；
所述双sgRNA包括宿主基因编辑sgRNA和质粒基因编辑sgRNA。


2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述Cas9蛋白表达框包括启动子、Cas9蛋白编码序列、核定位信号编码序列和终止子；
优选地，所述启动子包括TEF1；
优选地，所述核定位信号包括SV40核定位信号；
优选地，所述终止子包括CYC1。


3.根据权利要求1或2所述的质粒，其特征在于，所述双sgRNA表达框包括启动子、双sgRNA编码序列、酶切位点编码序列和终止子；
优选地，所述双sgRNA表达框包括启动子、酶切位点编码序列、宿主基因编辑sgRNA、酶切位点编码序列、质粒基因编辑sgRNA和终止子；
优选地，所述双sgRNA表达框包括启动子、酶切位点编码序列、宿主基因编辑sgRNA、酶切位点编码序列、Cas9蛋白编辑sgRNA和终止子；
优选地，所述启动子包括SNR52；
优选地，所述酶切位点包括BamH1识别位点和/或Pac1识别位点。


4.根据权利要求1-3任一项所述的质粒，其特征在于，所述质粒还包括复制起点和/或抗筛选标记编码序列；
优选地，所述筛选标记包括氨苄青霉素和/或遗传霉素。


5.一种制备权利要求1-4任一项所述的质粒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于合成宿主基因编辑sgRNA的编码序列的引物对、和用于合成质粒基因编辑sgRNA的编码序列的引物对，所述引物对的两端添加有同源臂；
优选地，所述引物的长度为55～70bp；
优选地，所述同源臂的长度为35～50bp；
优选地，所述试剂盒还包括含有Cas9蛋白表达框的表达载体；
优选地，所述表达载体包括pDuRCC-K；
优选地，所述试剂盒还包括限制性内切酶、DNA聚合酶或重组酶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述限制性内切酶包括BamH1和Pac1；
优选地，所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶；
优选地，所述重组酶包括T5核酸外切酶和高保真Taq酶；
优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、重组缓冲液或酶切缓冲液中的任意一种或...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱佑民，程倩，王梓旭，陶小倩，杨平，柳伟强，邢妍婧，赵一凡，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32