一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，提供了一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和应用，以I型鸭肝炎病毒及鸭脾脏为模板，通过RT‑PCR分别获得VP1和IL‑6基因，连接至PMD18‑T载体后保存备用；利用重叠延伸PCR技术得到VP1‑IL6融合基因，融合基因经双酶切后连接至表达质粒pPIC9中，将连接产物转化受体菌，最后鉴定阳性转座子，获得pPIC9‑VP1‑IL6阳性菌株；将表达产物添加LPS后与白油佐剂乳化后制作疫苗后免疫蛋鸡，制备卵黄抗体；本发明专利技术成功克隆DHV‑I的VP1及鸭IL‑6基因，并将两种基因构建成融合表达质粒，实现了重组质粒毕赤酵母高效表达，融合蛋白制备的卵黄抗体保护效果好，具有抗病毒和消炎双重作用。

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及家禽疫病免疫控制领域，涉及一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体的制备方法和应用，更为具体的涉及一种pPIC9-VP1-IL6重组质粒、构建方法、在毕赤酵母中的表达及其应用。
技术介绍
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(Duckhepatitisvirus，DHV)引起雏鸭的一种高度致死性传染病。临床上以具有明显神经症状和肝脏肿大、表面呈斑点样出血为特征，其主要侵害6周龄以内雏鸭，尤以2日至3周的雏鸭最为易感，成年鸭有抵抗力。随着近几年中国养鸭业快速发展，该病已成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一，给养鸭业带来了巨大的经济损失。鸭肝炎病毒包含小核糖核酸病毒科、星状病毒科、嗜肝病毒科3个病毒科的4种病毒，其中小核糖核酸病毒科的I型鸭肝炎病毒(DHV-I)呈世界性分布，毒力最强，感染率最高，危害也最严重。I型鸭肝炎病毒的发生和传播很快，雏鸭感染主要表现为精神萎靡、缩颈、翅下垂、厌食。患病鸭出现神经症状，角弓反张。大量死亡常在3-5d内发生。剖检病变主要集中在肝脏，表现为肝脏肿大、质脆易碎等现象，肝脏颜色暗淡或发黄，表面呈斑驳状；另外，胆囊、脾脏、胰腺等脏器也出现病变。由于该病主要危害雏鸭，而20日龄以内的雏鸭的免疫系统还未发育完全，对雏鸭进行疫苗免疫效果通常不理想，所以对本病最常用的防制方法是用疫苗免疫种鸭，使后代雏鸭获得高水平的母源抗体，从而预防该病。然而，由于种鸭免疫不及时、不规范，或者病毒变异造成雏鸭母源抗体水平不高或者中和效果变差等原因造成了临床发病率居高不下。目前商品代肉鸭普遍在3-4日龄时接种卵黄抗体以预防该病，或者在发病早期紧急接种卵黄抗体进行治疗。然而，临床反应注射精制卵黄抗体治疗时常常出现效果不理想的案例。研究发现，鸭肝炎病毒感染急、发病快，感染0.5-1d即可诱导大量的炎性细胞因子表达，造成“细胞因子风暴”，这是雏鸭大批死亡的重要原因。然而，目前的卵黄抗体成份主要为针对鸭肝炎病毒的特异性抗体，即使可以中和病毒，但是并没有消除炎症，对于发病高峰期鸭群中的重症雏鸭依然会快速死亡，这是临床上治疗鸭病毒性肝炎失败的主要原因。因此，如何有效降低雏鸭体内的炎症反应是提高抗体治疗效果的有效解决方法。炎性细胞因子是一类主要由免疫系统细胞生成的具有许多强大生物学效应的内源性多肽，可介导多种免疫反应。炎性细胞在体内过度表达可引起多器官衰竭的症状。研究发现，鸭肝炎病毒感染雏鸭后会诱导多种细胞因子表达量升高，包括IFN-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α等，其中IL-1β、IL-2、IL-6为促炎细胞因子，可以诱导严重的炎症反应。是否抑制这些细胞因子的活性就能够降低鸭体内的炎症反应的强度尚无相关研究，通过何种方式抑制，且抑制哪一种细胞因子活性的治疗效果最佳并不清楚。因此能否提供一种解决上述鸭肝炎病毒抗体水平不高，同时能够有效降低雏鸭体内的炎症反应的技术方案，成为本领域的技术难题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就在于克服上述现有技术的不足，提供一种具有抗炎作用的鸭病毒性肝炎卵黄抗体的制备方法和应用，特别提供了一种pPIC9-VP1-IL6重组质粒、构建方法、在毕赤酵母中的表达及其应用，以I型鸭肝炎病毒(DHV-I)及鸭脾脏为模板，通过RT-PCR分别获得VP1和IL-6基因，连接至PMD18-T载体后保存备用；重新设计扩增VP1和IL-6基因的引物，并在引物中加入linker序列及酶切位点，利用重叠延伸PCR技术得到VP1-Linker-IL-6(缩写为VP1-IL6)融合基因。融合基因经双酶切后连接至表达质粒pPIC9中，将连接产物转化受体菌，最后鉴定阳性转座子，获得pPIC9-VP1-IL6阳性菌株；将表达产物添加LPS后与白油佐剂乳化后制作疫苗后免疫蛋鸡，制备卵黄抗体。本专利技术成功克隆DHV-I的VP1及鸭IL-6基因，并将两种基因构建成融合表达质粒，实现了重组质粒毕赤酵母高效表达，融合蛋白制备的卵黄抗体保护效果好，具有抗病毒和消炎双重作用。本专利技术的具体技术方案如下：(1)以I型鸭肝炎病毒标准株(菌种保藏编号：CVCCAV1540，从保藏机构直接获得)为模板，设计扩增VP1基因的引物，具体为引物Primer1和2(如SEQIDNO：6和7所示)；根据NCBI公布的鸭IL-6的预测序列(序列号：XM_027450925.1)设计特异性引物，引物Primer5和6(如SEQIDNO：10和11所示)，扩增全长鸭IL-6基因。将VP1和IL-6的序列与pPIC9质粒谱图信息相比较，确定双酶切位点XhoⅠ和NotⅠ；(2)重组质粒pPIC9-VP1-IL6的构建，包括以下步骤：①I型鸭肝炎病毒VP1基因的PCR扩增：提取I型鸭肝炎病毒标准株(菌种保藏编号：CVCCAV1540，从保藏机构直接获得)RNA反转录为cDNA，将其作为模板，以引物Primer1和2(如SEQIDNO：6和7所示)，进行PCR扩增VP1基因，PCR产物胶回收，VP1基因序列如SEQIDNO：1所示；连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-VP1，保存备用；②以①中构建的质粒为模板，设计引物Primer3和4(如SEQIDNO：8和9所示)，上游引物Primer3引入XhoI酶切位点序列和HIS标签序列，下游引物Primer4中引入linker序列，PCR扩增得到VP1-Linker，如SEQIDNO：2所示；③鸭IL-6基因的PCR扩增：提取鸭脾脏RNA，反转录得到cDNA，PCR扩增鸭IL-6基因，所用引物为Primer5和6(如SEQIDNO：10和11所示)；PCR反应扩增鸭IL-6基因并胶回收后，连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-IL6重组质粒，保存备用；根据测序结果截取的鸭IL-6基因的编码区(CDs)序列如SEQIDNO：3所示；以③中构建的质粒为模板，设计引物Primer7和8(如SEQIDNO：12和13所示)，上游引物Primer7的起点为去除信号肽的IL-6序列，并在引物中引入linker，下游引物Primer8中引入NotI酶切位点序列，PCR扩增得到鸭IL-6-linker基因，如SEQIDNO：4所示；分别胶回收VP1-linker及IL-6-linker基因PCR扩增产物作为模板，以Primer3(如SEQIDNO：8所示)和Primer8(如SEQIDNO：13所示)为特异性引物进行SOE-PCR扩增，得到VP1-IL6融合基因(如SEQIDNO：5所示)；由于VP1-linker及IL-6-linker中均嵌入了linker连接子，可以在后续的扩增中融合在一起；④将胶回收得到的融合基因，16℃过夜连接至PMD18-T载体质粒，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-VP1-IL6重组质粒；⑤将重组质粒PMD18-T-VP1-IL6用上述XhoI和NotI限制性内切酶酶切，将切下的VP1-IL6融合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.pPIC9-VP1-IL6重组质粒，其特征在于：该重组质粒中含有VP1-IL6融合基因，该基因的序列如SEQ ID NO：5所示。/n

【技术特征摘要】
1.pPIC9-VP1-IL6重组质粒，其特征在于：该重组质粒中含有VP1-IL6融合基因，该基因的序列如SEQIDNO：5所示。


2.根据权利要求1所述的鸭圆环病毒组织灭活疫苗，其特征在于：所述VP1-IL6融合基因的获得方法如下：
分别提取I型鸭肝炎病毒RNA及鸭脾脏RNA，反转录后用PCR扩增I型鸭肝炎病毒VP1基因序列及鸭IL-6的基因序列，分别如SEQIDNO：1和3所示，然后将二者分别克隆至PMD18-T克隆质粒，备用；重新设计针对VP1和鸭IL-6基因的引物，在引物中加入保护性碱基、酶切位点和linker序列，使用PCR方式扩增获得VP1-Linker和IL-6-linker，其基因序列分别如SEQIDNO：2和4所示；通过重叠延伸PCR技术将两段序列扩增成VP1-IL6融合基因。


3.重组质粒pPIC9-VP1-IL6的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
①I型鸭肝炎病毒VP1基因的PCR扩增：
提取I型鸭肝炎病毒标准株RNA反转录为cDNA，将其作为模板，以引物Primer1和2，其基因序列如SEQIDNO：6和7所示，进行PCR扩增VP1基因，PCR产物胶回收，VP1基因序列如SEQIDNO：1所示；连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-VP1，保存备用；
②以①中构建的质粒为模板，设计引物Primer3和4，其基因序列如SEQIDNO：8和9所示，上游引物Primer3引入XhoI酶切位点序列和HIS标签序列，下游引物Primer4中引入linker序列，PCR扩增得到VP1-Linker，其基因序列如SEQIDNO：2所示；
③鸭IL-6基因的PCR扩增：提取鸭脾脏RNA，反转录得到cDNA，PCR扩增鸭IL-6基因，所用引物为Primer5和6，其基因序列如SEQIDNO：10和11所示；PCR反应扩增鸭IL-6基因并胶回收后，鸭IL-6基因的CDs序列如SEQIDNO：3所示；连接至PMD18-T载体质粒，得到PMD18-T-IL6，保存备用；
以③中构建的质粒为模板，设计引物Primer7和8，其基因序列如SEQIDNO：12和13所示，上游引物Primer7的起点为去除信号肽的IL-6序列，并在引物中引入linker，下游引物Primer8中引入NotI酶切位点序列，PCR扩增得到鸭IL-6-linker基因，其基因序列如SEQIDNO：4所示；
分别胶回收VP1-linker及IL-6-linker基因PCR扩增产物作为模板，以Primer3，其基因序列如SEQIDNO：8所示和Primer8，其基因序列如SEQIDNO：13所示为特异性引物进行SOE-PCR扩增，得到VP1-IL6融合基因其基因序列如SEQIDNO：5所示；
④将胶回收得到的融合基因，16℃过夜连接至PMD18-T载体质粒，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-VP1-IL6重组质粒；
⑤将重组质粒PMD18-T-VP1-IL6用上述XhoI和NotI限制性内切酶酶切，将切下的VP1-IL6融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接，经转化和酶切验证已连接，然后经质粒测序验证插入的外源基因序列正确，质粒命名为：pPIC9-VP1-IL6。


4.pPIC9-VP1-IL6重组质粒在毕赤酵母的表达的方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)VP1-IL6融合蛋白在毕赤酵母中的表达：
①将构建的重组质粒用SalI内切酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE缓冲液中；同时将pPIC9空载体质粒以相同酶切线性化，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金龙，丁树新，滕军，庄晓峰，赵学军，
申请(专利权)人：山东百瑞凯来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37