利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶及构建方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶及构建方法，将优化的精氨酸脱亚胺酶基因融合在酵母表达载体BDM上，构建单拷贝表达载体；利用限制性内切酶EcoRⅠ、SPeⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ四个酶进行酶切，根据SpeⅠ和XbaⅠ粘性末端能互补配对的原则，通过反复酶切、连接和转化操作，获得含精氨酸脱亚胺酶的重组质粒，电转毕赤酵母后，在甲醇诱导下能高效分泌表达精氨酸脱亚胺酶。本发明专利技术所构建的多拷贝高效表达精氨酸脱亚胺酶可用于提高产量、降低成本，实现精氨酸脱亚胺酶的胞外分泌表达，适用于精氨酸脱亚胺酶的规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶及构建方法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶及构建方法。
技术介绍
目前，精氨酸脱亚胺酶(Argininedeiminase,ADI)作为一种精氨酸降解酶，不可逆的催化精氨酸生成瓜氨酸和氨，精氨酸对于人类来说是一种非必须氨基酸，正常的细胞可经尿素循环通过精氨酸-琥珀酸合成酶(ASS)以及精氨酸-琥珀酸裂解酶(AL)催化瓜氨酸生成精氨酸，但不表达(ASS)，从而自身不能合成精氨酸，因此，通过精氨酸降解酶切断精氨酸对肿瘤细胞的供给，有可能从根本上消灭或控制精氨酸营养缺陷型癌细胞生长。现如今，制备精氨酸脱亚胺酶的方法包括化学合成法、微生物发酵法和酶法。化学合成法常常造成环境污染，环保大格局下化学合成法慢慢被取缔。微生物发酵法得到酶液常常含有大量杂酶，导致纯酶的获得成本较高。重组酶酶法合成由于反应条件温和、产率高、产物纯化简单而备受关注。这种方法涉及到一种酶——精氨酸脱亚胺酶，它可以将精氨酸水解成瓜氨酸和氨，目前，ADI来源有烟曲霉属真菌、蜡样芽孢杆菌、粉肠球菌、假本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效表达精氨酸脱亚胺酶的构建方法，其特征在于，所述高效表达精氨酸脱亚胺酶的构建方法通过密码子优化异源精氨酸脱亚胺酶基因，并利用基因工程手段将该基因整合到毕赤酵母基因组上，由起始信号元件醇氧脱氢酶强启动子、α-因子信号肽基因及融合在起始信号元件C端的精氨酸脱亚胺酶基因和终止信号构建了由甲醇作为诱导物的严谨性的分泌表达载体，通过电转毕赤酵母GS115感受态细胞，获得精氨酸脱亚胺酶表达受严格控制的重组表达工程菌种。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效表达精氨酸脱亚胺酶的构建方法，其特征在于，所述高效表达精氨酸脱亚胺酶的构建方法通过密码子优化异源精氨酸脱亚胺酶基因，并利用基因工程手段将该基因整合到毕赤酵母基因组上，由起始信号元件醇氧脱氢酶强启动子、α-因子信号肽基因及融合在起始信号元件C端的精氨酸脱亚胺酶基因和终止信号构建了由甲醇作为诱导物的严谨性的分泌表达载体，通过电转毕赤酵母GS115感受态细胞，获得精氨酸脱亚胺酶表达受严格控制的重组表达工程菌种。


2.如权利要求1所述高效表达精氨酸脱亚胺酶的构建方法，其特征在于，所述高效表达精氨酸脱亚胺酶的构建方法包括:
步骤一，根据GenBank提供的大肠杆菌K-12的精氨酸脱亚胺酶基因序列设计引物F、R，DNA为SEQIDNO：2，氨基酸序列为SEQIDNO：3以大肠杆菌基因组为模板扩增精氨酸脱亚胺酶基因，凝胶电泳条带约为1224bp；
步骤二，将PCR产物精氨酸脱亚胺酶基因进行纯化，连接到...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亚平，马立新，彭艳红，饶犇，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42