一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法，其中的鸭圆环病毒抗原是通过感染1日龄健康樱桃谷雏鸭，于25日龄采集感染鸭肝脏获得抗原组织，腺病毒抗原是通过感染20‑30日龄SPF雏鸡并采集死亡鸡只的肝脏获得；疫苗的抗原由质量比为1‑5:1的鸭圆环病毒和腺病毒肝脏组织组成，并制备疫苗用抗原液；并在抗原液中添加5‑40mg/mL浓度的松花粉多糖作为免疫增强剂，与常规白油佐剂乳化而成；所述卵黄抗体是将该疫苗免疫蛋鸡,然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到，同时含有抗鸭圆环病毒和腺病毒二种抗体，所提供的疫苗和卵黄抗体制备工艺简单、成本低、作用效果好，剂型稳定，易储存具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法
本专利技术涉及家禽疫病免疫控制领域，具体涉及一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法。
技术介绍
鸭圆环病毒(duckcircovirus，DuCV)是圆环病毒科圆环病毒属的新成员，无囊膜，单股环型DNA结构。该病毒于2003年由Hanemann在德国首次报道。在我国，姜世金等(2007)首次从2006年在福建省采集的鸭疫里默氏菌病鸭样品中检测到DuCV。刘少宁等(2008-2009)对来自山东、江苏、四川、福建和广东5个省份36个鸭群343份组织样品进行检测，发现DuCV检出率高达81.63％，鸭群阳性率达94.44％；其中山东18个肉鸭场阳性率为88.89％，12个种鸭场的阳性率为75％。这些数据说明鸭圆环病毒在中国主要养鸭省市鸭群中其感染相当普遍。从2016-2019年对全国各地发病鸭群的检测数据来看，DuCV的感染率仍然极高，并且多数与腺病毒、鸭细小病毒、坦布苏病毒、呼肠孤病毒、流感病毒和细菌等病原混感。对混感鸭群治疗发现，只要混感有DuCV的鸭群，都难以达到良好的治疗效果。DuCV感染过程缓慢，本身不造成明显的临床症状，因此非常容易被忽视，由于它主要侵害鸭的免疫系统，导致鸭抵抗力下降，因此极易造成其它病原的并发或继发感染，严重影响了治疗效果，造成了巨大的经济损失。由于目前DuCV在动物细胞和禽胚上难以增殖培养，因此目前尚无商品化疫苗。禽腺病毒属于腺病毒科、禽腺病毒属，是鸡、鸭、鹅等禽类体内常见的传染性病毒。禽腺病毒，特别是血清IV型，对鸡的致病力较强，但在鸭上，其症状通常不典型。该病在鸭感染初期往往无明显症状，死亡率较低，常见有精神萎顿、瘫痪、头颈震颤、高烧、排黄绿色稀便。然而在感染后期，患病家禽表现为精神沉郁，羽毛蓬松，特征性症状为突然倒地，两脚划空，数分钟内死亡。发病鸭群多于3周龄开始出现死亡，4-5周龄达到死亡高峰。病理解剖主要肝脏松软肿大并伴有出血，心包明显可见淡黄澄清的积液为特征性病变，肺脏出血、水肿，肾脏肿大出血，肠道出血等病变。该病一年四季均能发生，夏秋季节多发。该病主要通过种蛋、鸭胚垂直感染，也可通过粪便、飞沫水平传播。事实上，近一两年大量临床监测发现，肉鸭腺病毒感染相当普遍，甚至已经成为养殖场的常驻性病原。腺病毒单一感染的情况较少，基本上都是与鸭圆环病毒、新型鸭细小病毒、鸭肝炎病毒、流感病毒等混合感染，并易导致细菌继发感染的发生。目前腺病毒也没有商品化疫苗，鸭腺病毒的防控依然是个空白。卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体,由于卵黄中仅有特异性的IgY类抗体,故称其为卵黄免疫球蛋白IgY。与血清抗体相比,卵黄抗体具有很多独特的优点：(1)来源广、产量高、成本低，只需连续免疫蛋鸡，从高免鸡蛋的卵黄中纯化即可得到；(2)卵黄抗体有良好的稳定性,耐热耐酸,且常温下保存时间长；(3)特异性强，针对不同抗原产生特异性抗体，治疗效果确切；(4)无过敏原，安全、高效、无残留、环保。由于受到鸭圆环病毒疫苗和腺病毒疫苗制作技术的限制，目前尚无商品化的疫苗上市，市场空缺巨大，用于预防和治疗早期感染的卵黄抗体更是未见报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就在于克服上述现有技术的不足，提供一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法，其中的鸭圆环病毒抗原是通过腹腔注射感染1日龄健康樱桃谷雏鸭，每隔7天静脉注射加强感染一次，每次接种同时注射250mg/kg的环磷酰胺诱导免疫抑制加强病毒复制，于25日龄采集感染鸭肝脏组织获得；腺病毒抗原是通过感染20-30日龄SPF雏鸡并采集死亡鸡只的肝脏组织获得；疫苗所需的抗原液由质量比为1-5:1的鸭圆环病毒和腺病毒肝脏组织组成，经研磨、反复冻融、离心、过滤后制作而成，并添加5-40mg/mL浓度的松花粉多糖作为免疫增强剂，然后与常规白油佐剂乳化而成；所述卵黄抗体是将该疫苗免疫蛋鸡,然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到，同时含有抗鸭圆环病毒和腺病毒二种抗体，所提供的疫苗和卵黄抗体制备工艺简单、成本低、作用效果好，剂型稳定，易储存，在养鸭业中的开发利用潜力巨大，具有广阔的应用前景。综合考虑鸭圆环病毒和腺病毒的感染特性和流行情况，专利技术人认为这两种病原的防控意义重大，因此本专利技术公开了两种病原的产业化制备方法，并将两种病原联合制作成二联疫苗，同时添加免疫增强剂提高抗原的免疫原性，以达到同时预防这两种疾病的效果，从而为养鸭业的健康发展保驾护航，并且以该疫苗为基础，进一步制备获得了卵黄抗体，该卵黄抗体的安全性好,未出现由卵黄抗体引起的任何局部或全身不良反应，而且能够有效的预防和治疗鸭圆环病毒和腺病毒的感染,具有很好的商品化开发前景。本专利技术的具体专利技术构思如下：本专利技术所采用的鸭圆环病毒抗原为鸭的肝脏组织抗原。由于目前鸭圆环病毒难以体外培养，没有合适的细胞系，鸭胚上生长的也不理想，因此一直没有商品化的疫苗。又因为此病除了造成瘦小、免疫力下降之外，通常不表现出典型的临床症状，因此临床上容易受到忽视。不管是从临床意义还是技术难度上，该病毒的全病毒疫苗的研制一直是一个空白，也是现有技术缺失的环节。然而，近几年，鸭圆环病毒的感染率越来越高，危害越来越严重，疫苗研发的需求十分迫切。疫苗制作的关键是病毒的培养或保护性抗原的制备，有研究通过大肠杆菌或酵母菌等表达系统表达鸭圆环病毒的核衣壳蛋白，但是该方法制作要求高，纯化成本大，表达的抗原蛋白高级结构与天然的抗原结构存在明显差异，临床保护效果有待考证，而全病毒抗原不存在抗原性差的问题，但是如何解决圆环病毒的培养是现有技术中存在的显著难题。本专利技术从2019年众多发病的病料中分离、培养并连续传代驯化了一株鸭圆环病毒，该毒株在雏鸭体内生长良好，我们选用1日龄健康樱桃谷雏鸭接种该病毒，并采取间隔补接的技术及环磷酰胺人工诱导免疫抑制技术，大大提高了在鸭体内的病毒含量，使其能够达到疫苗制作的要求。本专利技术保存的鸭圆环病毒毒株为国内首次保藏，保藏编号为CGMCCNo.19296。如前所述，鸭圆环病毒通常与其他病毒或细菌混感，因此专利技术人认为单独的防控圆环病毒理论上并不能有效的控制疾病和混合感染，最佳的方式是联合容易与其混感的病毒制作成联苗，联合预防疾病才能起到更加显著的保护效果。血清IV型的腺病毒近五年来我国爆发的一种较新的病毒，之前在鸡上感染尤其严重，随着病毒的流行和发展，该病在鸭和鹅上的感染也越来越普遍，检出率高居不下，并且容易与鸭圆环病毒混感，除了造成实质性器官损伤外，也极大的破坏了免疫力，从而诱导更严重的细菌继发感染，对养禽业危害严重。由于血清IV型的腺病毒也没有合适的细胞系体外培养，在禽胚上繁殖也不理想，但是该病毒对雏鸡极其易感，特别是SPF鸡，感染之后通常在48-72h内致死雏鸡，死亡鸡的肝脏中含有大量的病毒。因此，本专利技术选用20-30日龄的SPF鸡感染一株纯化的腺病毒(保藏编号：CVCCAV211，从保藏机构直接获得)，用于制备疫苗用的抗原，该病毒株生长优良，前期试验证明保护效果良好，是一株特性优良的疫苗候选株。本专利技术首次将鸭圆环病毒和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其特征在于：其有效组分为：/n疫苗由质量比为1-5:1的鸭圆环病毒和腺病毒组织抗原液组成；同时抗原液中添加5-40mg/mL浓度松花粉多糖作为免疫增强剂；/n其中采用的鸭圆环病毒毒株的保藏编号为CGMCC No.19296。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其特征在于：其有效组分为：
疫苗由质量比为1-5:1的鸭圆环病毒和腺病毒组织抗原液组成；同时抗原液中添加5-40mg/mL浓度松花粉多糖作为免疫增强剂；
其中采用的鸭圆环病毒毒株的保藏编号为CGMCCNo.19296。


2.根据权利要求1所述的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其特征在于：
所述鸭圆环病毒抗原是通过将病毒腹腔注射病毒种感染1日龄健康樱桃谷雏鸭，此后每隔7天用静脉注射方式加强感染一次，每次感染病毒量不低于1×107copies，每次接种同时注射250mg/kg的环磷酰胺诱导免疫抑制加强病毒复制，于25日龄采集感染鸭整个肝脏组织，通过荧光定量PCR技术检测肝脏中的病毒含量≥1×108copies/g，即可作为原始抗原组织；
腺病毒抗原是通过肌肉注射病毒种感染20-30日龄SPF雏鸡并采集死亡鸡只的肝脏获得,感染病毒量不低于1×108copies，肝脏组织通过荧光定量PCR技术检测肝脏中的病毒含量≥1×109copies/g，即可作为原始抗原组织；
之后按照两种肝脏组织的重量1-5:1配比，然后再加5倍水一起研磨、匀浆、冻融、离心、过滤制备疫苗用抗原液；同时，抗原液中添加5-40mg/mL浓度松花粉多糖作为免疫增强剂；
抗原液经过甲醛灭活，与白油佐剂乳化，制作而成疫苗。


3.根据权利要求1所述的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其特征在于：
所述的二联灭活疫苗中鸭圆环病毒和腺病毒两种肝脏组织的重量比为2-4:1，松花粉多糖的浓度为10-30mg/mL。


4.根据权利要求1或3所述的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗，其特征在于：所述的二联灭活疫苗鸭圆环病毒和腺病毒两种肝脏组织的重量比为3:1，松花粉多糖的浓度为20mg/mL。


5.权利要求1所述的鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
选用1日龄健康樱桃谷雏鸭腹腔注射接种纯化的鸭圆环病毒毒种，每隔7天静脉注射补接一次，每次感染病毒量不低于1×107copies，每次感染时同时注射250mg/kg剂量的环磷酰胺人工诱导免疫抑制以利于病毒复制，至25日龄时，采集鸭肝脏，检测鸭圆环病毒的含量≥1×108copies/g，备用；
选用20-30日龄SPF鸡接种纯化的腺病毒毒种，感染病毒量不低于1×108co...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金龙，丁树新，庄晓峰，滕军，
申请(专利权)人：山东百瑞凯来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37