真核细胞系制造技术

本发明专利技术涉及细胞系、所述细胞系的用途以及使用所述细胞系制备感染性病毒颗粒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】真核细胞系本专利技术涉及细胞系、所述细胞系的用途以及使用所述细胞系制备感染性病毒颗粒的方法。专利技术背景需要新型疫苗来预防或治疗诸如HIV、丙型肝炎、疟疾、结核病和癌症等疾病。临床前和临床证据支持T细胞免疫，尤其是CD8+T细胞在清除这些疾病中的作用。诱导针对特定抗原的CD8+T细胞应答的一种方法是通过基因递送在细胞内表达该抗原和合适的病原体衍生的先天激活因子；基因疫苗或基于基因的疫苗采用生理抗原加工和I类主要组织相容性复合物(MHC)来激活CD8+T细胞应答。复制缺陷型腺病毒载体已通过用表达盒替换抗原的必需E1区而广泛用于基因疫苗。腺病毒载体作为基因递送系统是有吸引力的，因为它们即感染复制细胞也感染非复制细胞，具有广泛的组织趋向性，在可用的包装细胞系中非常有效地繁殖，并且具有可扩展且可负担的生产过程。实际上，在动物模型和人类临床试验中，基于腺病毒的载体比基于痘病毒、慢病毒、α病毒和裸露的DNA的其他遗传疫苗载体能诱导更有效的抗原特异性CD8+T细胞。然而，腺病毒载体作为基因疫苗载体的成功开发最终将不仅取决于它们的免疫效力，而且取决于可扩展和可再现的生产过程中细胞底物的可用性。腺病毒载体能够表达高水平的抗原蛋白，它们不仅在体内靶组织中递送，而且在补体细胞系(complementingcellline)的生产过程中递送。在当前的载体系统中，转基因表达是由强大的人巨细胞病毒即/早期启动子(HCMV启动子，humancytomegalovirusimmediate/earlypromoter)驱动的，在载体生产过程中该启动子不仅在靶组织中而且在包装细胞系中均可以高水平表达。一些证据表明，包装细胞系中的高转基因表达可以干扰腺病毒的复制。在我们对腺病毒载体拯救和繁殖的广泛经验中，已经观察到转基因过表达对病毒复制的有害影响，从降低的载体产量到完全抑制复制。另外，通过选择重排的载体种类，对载体复制的干扰可能导致载体本身的遗传不稳定性。在生产过程中能够抑制腺病毒载体携带的转基因表达的细胞系的开发可以防止转基因过表达的负面影响。因此，该系统是基于表达高水平TetR的细胞系，并且是通过携带在人类巨细胞病毒启动子或其他强启动子的控制下的转基因的腺病毒载体，其他强启动子如CASI启动子、CAG启动子、EF1α启动子，其具有两个或多于两个拷贝的插入启动子TATA框的下游的TetR结合位点。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了一种细胞系，其中四环素阻遏物(Tet-R)在细胞或部分细胞启动子的控制下表达。在第二方面，本专利技术涉及根据本专利技术第一方面的细胞系在制备感染性病毒颗粒中的用途。在第三方面，本专利技术涉及一种生产感染性病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：(i)使本专利技术的第一方面的细胞系的细胞生长，所述细胞还包含在不存在四环素或四环素类似物的情况下能够体外组装成感染性病毒颗粒的病毒基因组；或(ii)用病毒载体，优选腺病毒载体感染本专利技术第一方面的细胞系的细胞；和(iii)回收病毒颗粒。附图说明在下文中，描述了本说明书中包括的附图的内容。在此上下文中，还请参考上面和/或下面的本专利技术的详细描述。图1：pneo/CAG-TetR图。Pneo/CAG-TetR包含四环素阻遏物和G418抗性基因的表达盒。图2：SeAP在克隆M9和M38中的表达。将克隆接种在培养瓶T25中，并在存在或不存在四环素的情况下以moi30(感染复数)使其感染ChAdETetOSeap。然后通过计算有和没有四环素的情况下感染后48小时的比率，获得每个单个克隆的得分。克隆M9显示最佳比率+/-tet。图3：在M9、M38和Hek293细胞中产生AdTetOE1E2p7。使M9、M38和HEK293以moi100(感染复数)感染AdTetOE1/F78E2p7(没有TetR介导的表达控制不能生长的腺病毒载体)。克隆M9和M38显示出最佳的产量值。图4：TetR蛋白在M9和M38细胞中的表达。通过使用TetR抗体对克隆M9和M38的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析来评估TetR表达。TetR在M9和M38细胞中均高水平表达。图5：在M9细胞中Ch9载体的拯救效率。与HEK-293相比，在M9细胞中评估了C类和E类腺病毒载体(ChAdN13TPA4-T1Poly(图5A)和ChAdEegfp(图5B))的拯救效率。用前腺病毒(preAd)质粒DNA平行转染M9和HEK293细胞的单层细胞。转染后12天基于细胞裂解液通过QPCR评估病毒的产生。结果表明，转染后在M9细胞中产生腺病毒载体的效率更高。图6：ChAdC-Venus和ChAdE-EGFP载体的产量。与HEK293和293T细胞相比，评估了黑猩猩腺病毒载体ChAdC-Venus(图6A)和ChAdE-EGFP(图6B)在M9细胞中的产量。使用相同的ChAd感染复数感染细胞单层。感染后72小时收获细胞，并通过QPCR评估粗裂解物中的载体效价。结果表示为细胞特异性的产量。图7：通过FACS分析评估M9和T-Rex细胞中的转录控制。将细胞系接种在T25培养瓶中，并用ChAdCTetO-VENUS以moi＝100vp/细胞(感染复数)对其进行感染。在单细胞水平上足够量的TetR的表达会关闭venus报告基因的表达。3.8％的M9细胞显示出可检测到的荧光信号，而T-Rex细胞为26％。已证明M9细胞系能够控制96.2％的细胞中的基因表达，而74％的T-Rex细胞有效地控制了表达。图8：M9(图8A)和T-Rex(图8B)细胞系中的ChAd载体产量。分析是在接种于T培养瓶中的细胞中进行的(T25培养瓶中在10ml培养基中接种了5E6个细胞)。用ChAd-CTetO-VENUS以100vp/细胞的感染复数感染细胞单层。当通过显微镜观察(感染后7天)观察到完全的CPE时，收获细胞。通过QPCR方法用HCMV启动子DNA序列的经设计的探针和引物测定载体的产量。图9：腺病毒载体和表达盒的图。腺病毒载体携带带有TetO的HCMV启动子，且表达盒包含TetO序列。图10：将CAG启动子驱动的TetR表达与HCMV驱动的表达相比。HCMV-TetR293细胞首先是通过在HEK293细胞中转染HCMV-TetR表达载体而开发的。通过G418选择来分离表达TetR的克隆并进行扩增。在40代和60代通过蛋白质印迹检测TetR的表达，并与60代M9细胞中的TetR的表达进行比较。从3E+06细胞中提取总细胞蛋白，在SDS-PAGE上分离，转移至膜上并用抗TetR抗体探测(抗体稀释度：1:1000，在4℃孵育12小时)。结果表明，由HCMV启动子驱动的TetR表达在细胞培养传代过程中逐渐丢失，而由CAG启动子驱动的TetR表达则经过传代(p60)后保持不变。图11：通过表观遗传机制的HCMV启动子沉默。HCMV-TetR细胞系中观察到的TetR表达逐渐丢失可以通过将细胞暴露于HDAC抑制剂(Belinostat)来恢复。在200nM的B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞系，其中在细胞启动子或部分细胞启动子的控制下表达四环素阻遏物(Tet-R)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171025 EP 17198339.81.一种细胞系，其中在细胞启动子或部分细胞启动子的控制下表达四环素阻遏物(Tet-R)。


2.根据权利要求1所述的细胞系，其中在所述细胞系的至少90％的细胞中表达四环素阻遏物(Tet-R)。


3.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中表达随时间稳定。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞系，其中在存在或不存在四环素或四环素类似物的情况下，Tet-R抑制在所述细胞系的启动子中包含了一种或多于一种四环素操纵子(TetO)的基因的转录。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞系，其中所述Tet-R基因受组成型启动子的控制，优选地，所述组成型启动子选自EF1α启动子、PGK-1启动子、泛素B启动子、β-肌动蛋白启动子、EGR1启动子、CASI启动子和CAG启动子。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞系，其中对编码Tet-R的基因在真核细胞，优选在哺乳动物细胞中的表达进行密码子优化。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞系，其还包含
(i)在其基因组中的突变、缺失或插入，所述突变、缺失或插入减少或阻止选自一种或多于一种IFN基因，优选cGas和STING的刺激因子、一种或多于一种JAK/STAT转录激活因子和一种或多于一种IFN刺激基因(ISG)，优选PKR、MX1、OAS1、APOBEC3G、TRIM5、ZAP、ISG15、ADAR、IFITM1/2/3、BST2和/或RSAD2的功能蛋白的表达，和/或
(ii)编码选择标记的基因，优选与编码Tet-R的基因遗传连接的G418、潮霉素B、嘌呤霉素、杀稻瘟素或吉欧霉素抗性基因。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞系，其包含稳定整合到其基因组中的编码四环素阻遏物(Tet-R)的基因。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系的细胞表达形成感染性病毒颗粒所需的至少一种病毒基因，优选其中所述至少一种病毒基因选自E1，优选包含具有SEQIDNO：1的核苷酸序列的基因。


10.根据权利要求1至9中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯特凡诺·科洛卡，阿尔弗雷多·尼科西亚，
申请(专利权)人：NOUSCOM股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH