用于预防和治疗微卫星不稳定(MSI)癌症的基于共有肿瘤新抗原的通用疫苗制造技术

本发明专利技术涉及选择移码肽的集合(CFSP)以产生通用癌症疫苗肽集合(CVP)的方法，该通用癌症疫苗肽集合用于预防和治疗患有遗传性和散发性微卫星不稳定性(MSI)肿瘤的患者。本发明专利技术还涉及通过从CFSP中选择移码肽(FSP)的子集并任选地修饰FSP的氨基酸(aa)序列以产生修饰的FSP(mFSP)来产生CVP的方法。本发明专利技术还涉及在也可以同时使用的一种或多于一种疫苗载体中编码FSP和/或mFSP的CVP的核酸集合。这些CVP、核酸和载体可用于预防或治疗MSI癌症。

A universal vaccine based on new common tumor antigens for the prevention and treatment of microsatellite instability (MSI) cancer

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于预防和治疗微卫星不稳定(MSI)癌症的基于共有肿瘤新抗原的通用疫苗本专利技术涉及选择移码肽的集合(CFSP)以制备通用癌症疫苗肽集合(CVP)的方法，该通用癌症疫苗肽集合用于预防和治疗遗传性和散发性微卫星不稳定性(MSI)肿瘤的患者。本专利技术还涉及通过从CFSP中选择移码肽(FSP)的子集并任选地修饰FSP的氨基酸(aa)序列以产生修饰的FSP(mFSP)来制备CVP的方法。本专利技术还涉及在也可以同时使用的一种或多于一种疫苗载体中编码具有FSP和/或mFSP的CVP的核酸集合。这些CVP、核酸和载体可用于预防或治疗MSI癌症。专利技术背景癌症疫苗领域长期以来一直专注于靶向与肿瘤相关的抗原，以及最近的肿瘤特异性抗原。后者可在癌细胞中由致癌病毒蛋白或编码基因的体细胞突变引起，导致肿瘤新抗原的产生，之所以如此定义是因为正常细胞中不存在这种新抗原。虽然肿瘤新抗原因为自身耐受和自身免疫的风险较低而更具吸引力，但肿瘤新抗原在特定患者的癌细胞之间以及在整个人群中差异很大，从而阻碍了基于共有肿瘤新抗原的有效通用癌症疫苗的开发。但是，由于存在的一组癌症的潜在的生物学特性，其不遵循该一般规则：经常由DNA错配修复基因(MMR)突变引起的微卫星不稳定(MSI)肿瘤。有缺陷的MMR系统会导致在称为微卫星的重复核苷酸序列区域中的突变积累。编码基因的微卫星上的突变可导致翻译阅读框的移位，从而导致C端由称为移码肽(FSP)的新型非自身肽组成的嵌合蛋白。与大多数癌症不同，MSI肿瘤中的突变优先出现在由单核苷酸重复(MNR)组成的微卫星中。在编码区内，此类突变主要由1个核苷酸缺失组成，并影响有限数量的基因，因此在患者之间共有(Kim，T.M.等人(2013)Cell155(4)：858-868)。因此，与MSI相关的癌症为基于共有肿瘤新抗原设计通用疫苗提供了独特的机会。MSI肿瘤包括分别由MMR基因中的体细胞和种系突变引起的散发性和遗传性癌症。林奇综合症(LS)是一种属于第二组的罕见疾病(ORPHA144)。特别是，MMR通路的MSH2或MLH1基因(约90％的遗传LS携带者)中具有杂合种系突变的个体患癌的风险更高。具体而言，有＞50％的病例在他们一生中倾向于患上结肠癌或子宫内膜癌(Boland，C.R.和A.Goel(2010)Gastroenterology138(6)：p.2073-2087e3)。总而言之，本文描述的专利技术涉及在MSI肿瘤中鉴定共有的FSP新抗原，并涉及基于衍生自CFSP的FSP和修饰的FSP的子集(定义为CVP)的通用疫苗的开发，用于MSI癌症的治疗和其预防，特别是在LS携带者中。这些CVP尤其可以提供以下优势：(i)对多种MSI癌症有良好的治疗和/或预防性免疫应答；(ii)一种即用的现成的疫苗，由于其编码大量共有的FSP，因此可以在大量患者中使用并且有效；(iii)可以以适合于治疗和预防任何MSI癌症的方式选择特定的CVP，这在预防情况下特别有用；(iv)由于排除了潜在的自身表位，因此没有自身免疫应答的风险。据专利技术人所知，本专利技术的方法的特征在于以前未知的各种特征，包括：(i)各种保障措施，例如a)从所选肿瘤类型中平均表达高于阈值的基因中选择移码肽，b)选择健康对象的组织中不存在或非常罕见的移码肽，c)排除移码肽中与正常人蛋白质中长度为8个或多于8个氨基酸的区段相同的区段，和c)使用大量癌症样品。(ii)包含比最小假定CD8+T细胞表位(8聚体)短的移码肽。这是通过添加最多4个野生型氨基酸以生成至少8个氨基酸的肽来实现的。(iii)选择要包含在疫苗中的移码肽的最佳集合，以使每个单独的癌症样品(癌症样品代表疫苗靶向的群体)均包含由疫苗编码的移码肽的一部分并且在该部分中代表的移码肽的总长度为至少400个氨基酸。针对靶向病毒抗原的疫苗的临床试验表明，平均需要400个氨基酸的病毒抗原，即像移码肽一样的非自身抗原，才能在每位患者中产生至少1个免疫原性T细胞应答。尽管对于每个癌症样品，所覆盖的移码肽的一部分将有所不同(即，每个癌症样品包含移码突变的不同子集，因此，最佳集合中存在不同的移码肽子集)，但是以每个肿瘤样品中覆盖的移码肽的部分具有至少400个氨基酸的总长度这样的方式选择最佳集合。因此，将该400个氨基酸规则整合到所公开的选择方法中，从而确保针对疫苗靶向群体的肿瘤中存在的FSP诱导T细胞。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及一种选择移码肽的集合(CFSP)以制备通用的微卫星不稳定性(MSI)癌症疫苗肽集合(CVP)的方法，以用于预防或治疗患有癌症或具有发展成这种癌症的风险的患者，该癌症包括遗传性和散发性MSI癌症，该方法包括以下步骤：(i)选择核酸的集合(CFSM)，每个核酸包含移码突变(FSM)，每个FSM存在于至少M个癌症样品(CS)的一个或多于一个中，每个癌症样品的患者均不同，其中患者的癌症包括具有MSI表型的癌细胞；其中所选的至少50％的FSM满足标准(a)、(b)、(c)和/或(d)：(a)FSM存在于长度等于或大于6个核苷酸的编码基因的单核苷酸重复(MNR)中；(b)FSM对应于1个核苷酸的缺失；(c)与匹配的正常样品相比，肿瘤样品中带有FSM的DNA测序读取的数目明显更高(经FDR校正的Fisher检验p值等于或小于0.05)；(d)FSM存在于匹配的正常样品中，其等位基因频率低于25％，(ii)选择X个不同的移码肽(FSP)，其中每个选定的FSP是包含至少4个氨基酸长度的CFSM的FSM的核酸的蛋白质编码片段的完整翻译产物，所述至少4个氨基酸长度从与没有FSM的相应野生型(wt)核酸的翻译产物不同的编码第一个氨基酸的密码子开始，其中X至少为20，更优选至少为35，且M至少为5。在第二方面，本专利技术涉及一种确定包含在CVP中的肽的氨基酸序列或编码包含在CVP中的该肽的核酸序列的氨基酸序列的方法，其包括以下步骤：(a)从根据本专利技术的第一方面选择的CFSP中选择至少Y个FSP或其至少8个氨基酸长的片段；(b)修饰那些满足以下条件的一个或多于一个或所有FSP的氨基酸序列：(i)FSP的长度为4个至9个氨基酸，和/或(ii)FSP包含一种或多于一种相同的8个或多于8个氨基酸的连续片段，其存在于由相同FSM编码的多于一种FSP中和/或(iii)FSP包含一种或多于一种8个或多于8个氨基酸的连续片段，其也存在于wt人蛋白质中，其中根据(i)的FSP的氨基酸序列通过在FSP的N端添加野生型(wt)氨基酸序列的1个至4个氨基酸来进行修饰，该野生型(wt)氨基酸序列紧邻FSP的上游，并且其中修饰的FSP(mFSP)的长度至少为8个氨基酸；根据(ii)的FSP的氨基酸序列通过从除最长FSP之外的所有FSP中除去这些连续片段来进行修饰，条件是在除去连续片段后长度小于4个氨基酸的FSP被排除在CVP之外；和/或根据(iii)的FSP的氨基酸序列通过除去这些片段来进行修饰；除去连续序列后长度小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种选择移码肽的集合(CFSP)以产生通用的微卫星不稳定性(MSI)癌症疫苗肽集合(CVP)的方法，以用于预防或治疗患有癌症或具有发展成这种癌症的风险的患者，所述癌症包括遗传性和散发性MSI癌症，所述方法包括以下步骤：/n(i)选择核酸的集合(CFSM)，每个核酸包含移码突变(FSM)，每个FSM存在于至少M个癌症样品(CS)的一个或多于一个中，每个癌症样品的患者均不同，其中患者的癌症包括具有MSI表型的癌细胞；/n其中所选的至少50％的FSM满足标准(a)、(b)、(c)和(d)：/n(a)FSM存在于长度等于或大于6个核苷酸的编码基因的单核苷酸重复(MNR)中；/n(b)FSM对应于1个核苷酸的缺失；/n(c)与匹配的正常样品相比，肿瘤样品中带有FSM的DNA测序读取的数目明显更高(经FDR校正的Fisher检验p值等于或小于0.05)；/n(d)FSM存在于匹配的正常样品中，其等位基因频率低于25％，/n(ii)选择X个不同的移码肽(FSP)，其中每个选定的FSP是包含至少4个氨基酸长度的CFSM的FSM的核酸的蛋白质编码片段的完整翻译产物，所述至少4个氨基酸长度从与没有FSM的相应野生型(wt)核酸的翻译产物不同的编码第一个氨基酸的密码子开始，/n其中X为至少20，更优选为至少35，且M为至少5。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170712 EP 17181026.01.一种选择移码肽的集合(CFSP)以产生通用的微卫星不稳定性(MSI)癌症疫苗肽集合(CVP)的方法，以用于预防或治疗患有癌症或具有发展成这种癌症的风险的患者，所述癌症包括遗传性和散发性MSI癌症，所述方法包括以下步骤：
(i)选择核酸的集合(CFSM)，每个核酸包含移码突变(FSM)，每个FSM存在于至少M个癌症样品(CS)的一个或多于一个中，每个癌症样品的患者均不同，其中患者的癌症包括具有MSI表型的癌细胞；
其中所选的至少50％的FSM满足标准(a)、(b)、(c)和(d)：
(a)FSM存在于长度等于或大于6个核苷酸的编码基因的单核苷酸重复(MNR)中；
(b)FSM对应于1个核苷酸的缺失；
(c)与匹配的正常样品相比，肿瘤样品中带有FSM的DNA测序读取的数目明显更高(经FDR校正的Fisher检验p值等于或小于0.05)；
(d)FSM存在于匹配的正常样品中，其等位基因频率低于25％，
(ii)选择X个不同的移码肽(FSP)，其中每个选定的FSP是包含至少4个氨基酸长度的CFSM的FSM的核酸的蛋白质编码片段的完整翻译产物，所述至少4个氨基酸长度从与没有FSM的相应野生型(wt)核酸的翻译产物不同的编码第一个氨基酸的密码子开始，
其中X为至少20，更优选为至少35，且M为至少5。


2.根据权利要求1所述的方法，其中至少50％的被选择的FSP满足以下一个或多于一个标准：
(a)FSP由观察到具有癌症类型特异性频率(CF)的FSM编码，所述癌症类型特异性频率(CF)是对于特定类型癌症的CS子集观察到的，所述子集是M个不同CS的集合的一部分，即对于CS中存在的至少一种癌症类型，癌症类型特异性频率至少为5％；和/或
(b)具有编码FSP的FSM的基因的平均mRNA表达水平在描述CS中每个蛋白质编码基因的平均mRNA表达值的分布的前80个百分点中；和/或
(c)在一组没有癌症的对象的正常组织中观察到产生FSP的FSM少于2％。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中：
(i)CS来自患有MSI肿瘤的患者，所述MSI肿瘤优选结肠直肠癌和/或胃癌和/或子宫内膜癌，更优选结肠直肠癌、胃癌和子宫内膜癌；和/或
(ii)M为至少10，优选至少10，优选至少30，优选至少50，更优选至少100，更优选至少200，最优选至少300；和/或
(iii)X为至少35，优选至少50，优选至少100，更优选至少200。


4.一种确定包含在CVP中的肽的氨基酸序列或编码包含在CVP中的肽的核酸序列的氨基酸序列的方法，其包括以下步骤：
(a)从根据权利要求1至3中任一项所选择的CFSP中选择至少Y个FSP或其至少8个氨基酸长的片段；
(b)修饰满足以下标准的一种或多于一种或所有FSP的氨基酸序列：(i)FSP的长度为4个至9个氨基酸，和/或(ii)FSP包含一种或多于一种相同的8个或多于8个氨基酸的连续片段，其存在于由相同FSM编码的多于一种FSP中，和/或(iii)FSP包含一种或多于一种8个或多于8个氨基酸的连续片段，其也存在于wt人蛋白质中，
其中根据(i)的FSP的氨基酸序列通过在FSP的N端添加野生型(wt)氨基酸序列的1个至4个氨基酸来进行修饰，所述野生型(wt)氨基酸序列紧邻FSP的上游，并且其中修饰的FSP(mFSP)的长度为至少8个氨基酸；根据(ii)的FSP的氨基酸序列通过从除最长FSP之外的所有FSP中除去这些连续片段来进行修饰，条件是在除去连续片段后长度少于4个氨基酸的FSP被排除在CVP之外；和/或根据(iii)的FSP的氨基酸序列通过除去这些片段来进行修饰；除去连续片段后长度少于4个氨基酸的修饰的FSP被排除在CVP之外，
其中CVP的氨基酸序列包含在步骤a)中选择和/或在步骤(b)中修饰的FSP或其片段的氨基酸序列；
并且其中Y为至少20，更优选至少35。


5.根据权利要求4所述的方法，其中在步骤(a)中，从CFSP中连续地选择CVP的FSP，并且在每个选择步骤中，从CFSP中选择新的FSP，其增加低于阈值(TV)的FSP氨基酸总长度的累积量(CAFSPL)，以在最大癌症样品数中达到阈值(TV)，并且任选地，如果多于一种FSP增加了最大癌症样品数的CAFSPL，且CAFSPL仍低于阈值，则选择得分最高的FSP。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其中：
(i)通过将已经是CVP的一部分的FSP的氨基酸长度与来自CFSP的新FSP的氨基酸长度相加来确定每个癌症样品的CAFSPL，其中相应的FSM存在于癌症样品中；和/或
(ii)其中阈值是针对属于特定癌症类型的CS中样品的每个子集分别定义的；和/或
(iii)其中将得分定义为FSP的氨基酸长度与在CS中观察到生成FSP的FSM的总频率之间的乘积，任选地不计算其中CF低于5％的癌症类型的CS中的FSM，和/或
(iv)其中癌症样品的子集包括来自肿瘤类型的所有癌症样品，其中存在CF大于或等于5％的FSM；和/或
(v)其中由总频率低于5％的FSM产生的FSP被排除在选择之外；和/或
(vi)其中继续添加新的FSP和/或修饰的FSP，直到没有其他包含在CVP中会增加任何癌症样品的CAFSPL的FSP可用，其中所述任何癌症样品的CAFSPL仍低于阈值或CVP中存在的所有FSP的累积长度已经达到V个氨基酸的最大值；和/或
(vii)其中源自同一FSM的FSP被视为一种FSP，其中综合得分被计算为各种FSP得分的和。


7.根据权利要求5或6所述的方法，其中继续添加新的FSP，直到不再有其他包含在CVP中会增加任何癌症样品的CAFSPL的FSP可用，其中所述任何癌症样品的CAFSPL仍低于TV；和/或
其中源自同一FSM的FSP被视为一种FSP，其中综合得分被计算为各种FSP得分的和。


8.根据权利要求6或7所述的方法，其中：
(a)TV为至少400个氨基酸，优选至少600个氨基酸，更优选至少800个氨基酸；或
(b)TV：
(i)针对结肠直肠癌和胃癌为至少400个氨基酸，优选至少600个氨基酸，更优选至少800个氨基酸；和
(ii)针对子宫内膜癌为至少200个氨基酸，优选至少300个氨基酸，更优选至少400个氨基酸。


9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中：
(i)CVP包含选自CFSP的每个FSP的至少4个氨基酸；和/或
(ii)选择Y，使得作为CVP一部分的所有肽的累积氨基酸长度V为至少280个氨基酸，优选至少6000个氨基酸；
(iii)Y为至少35，优选至少50，优选至少100，更优选至少200，和/或
(iv)CVP包括的FSP和/或mFSP选自根据SEQIDNO：1至1087的FSP和/或mFSP，优选地选自根据SEQIDNO：1至209的FSP和/或mFSP。


10.一种产生CVP或编码所述CVP的核酸的集合的方法，其包括以下步骤：
(i)获得在根据权利要求4至10中任一项所述的方法中确定的氨基酸序列信息或核酸序列信息；和
(ii)合成一种或多于一种多肽中的CVP的氨基酸序列或具有所述序列的核酸的集合，并任选地将核酸的集合插入一种或多于一种表达盒和/或表达载体的集合中。


11.一种通过根据权利要求10所述的方法能够产生的CVP或编码所述CVP的肽的核酸的集合。


12.一种包含Y个不同的FSP和/或mFSP或其片段或由Y个不同的FSP和/或mFSP或其片段组成的CVP，其长度为至少8个氨基酸，其中每个FSP或被修饰成mFSP的FSP是包含FSM的核酸的蛋白质编码片段的片段或完整翻译产物，所述包含FSM的核酸从与没有FSM的相应wt核酸的翻译产物不同的编码第一个氨基酸的密码子开始，所述FSM在任何情况下具有至少4个氨基酸长度，并且其中至少50％的FSP或被修饰为mFSP的FSP满足以下一个或多于一个标准：
(a)FSP由观察到具有癌症类型特异性频率(CF)的FSM编码，所述癌症类型特异性频率(CF)是对于特定类型癌症的CS的子集观察到的，所述子集是M个不同CS的集合的一部分，即对于CS中存在的至少一种癌症类型，癌症类型特异性频率至少为5％；和/或
(b)具有编码FSP的FSM的基因的平均mRNA表达水平在描述CS中每个蛋白质编码基因的平均mRNA表达值的分布的前80个百分点中；和/或
(c)在一组没有癌症的对象的正常组织中观察到产生FSP的FSM少于2％，
其中满足以下标准的一种或多于一种或所有FSP的氨基酸序列：(i)由包含从由FC编码的氨基酸开始的FSM的核酸所编码的FSP的长度为4个至9个氨基酸，和/或(ii)FSP包含一种或多于一种相同的8个或多于8个氨基酸的连续片段，其存在于由相同FSM编码的多于一种FSP中，和/或(iii)FSP包含一种或多于一种8个或多于8个氨基酸的连续片段，其也存在于wt人蛋白质中，
对于根据(i)的FSP，通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿尔弗雷多·尼科西亚，埃莉萨·斯卡尔塞利，圭多·莱昂尼，阿明·拉姆，
申请(专利权)人：NOUSCOM股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH