酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用技术

本发明专利技术公开了酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用，本发明专利技术通过同源重组的手段，将生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块6个基因：tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9和HcOSC6基因均导入酿酒酵母中得到初始重组菌Cuol01，发现其可产生葫芦二烯醇；再导入甲羟戊酸途径的上游模块7个基因：ERG12、ERG13、ERG19、ERG8、IDI、tHMG1和ERG10基因的表达，得到最终重组菌Cuol02，其葫芦二烯醇产量明显提高；为人工合成达玛二烯和原人参二醇奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用
本专利技术属于生物技术
，具体涉及一种酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用。
技术介绍
葫芦二烯醇(cucurbitadienol)是从葫芦科多种植物中分离得到的葫芦烷型四环三萜化合物，药理活性研宄表明葫芦二烯醇具有显著的抗炎、抗肿瘤作用，而且葫芦二烯醇是葫芦素类和罗汉果甜苷等化合物的三萜碳骨架，为其生物合成的关键前体化合物。葫芦素已被报道具有良好的抗癌活性，其中葫芦素B、D和葫芦素E、I细胞毒性显著。通过特异阻断肿瘤细胞生长所需的JAK-STAT信号通路来抑制肝癌、膀胱癌、胰腺癌等癌细胞的扩散，可与其他抗癌药物一块使用，提高癌症治疗的效果。此外，各种葫芦素还具有抗糖尿病、抗肥胖显著的降血糖和降血糖作用，例如来自苦瓜中的葫芦烷糖苷和苦瓜苷。雪胆属植物块茎中富含葫芦素类和其他三萜皂苷成分，特别是从该属植物中提取的雪胆素(雪胆甲素和雪胆乙素混合物)开发成“雪胆素片”，具有清热解毒、抗菌消炎等多种功效，临床上用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎及急性扁桃体炎等多种疾病。国内外学者还发现雪胆甲素具有明显的细胞毒性作用，通过抑制JAK2/STAT3下游的生存素(Survivin)，破坏肌动蛋白细胞骨架，引导细胞发生PARP介导的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖，使其成为一类新型的抗癌药物。雪胆属植物中葫芦素含量均非常低，由于人类无序采挖等原因，雪胆类药材野生资源正在日益减少，同时，雪胆素提取原材料的种植周期长，并且对种植地块和种植技术要求较高。因此，如何能够高效地获得这些有用的次生代谢物，缓解野生资源压力，一直都是科研究人员思考和研究的问题。目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(ParayilKumaranAjikumaretal.,2010,Science,330:70-74)；银杏内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/L的产量(EffendiLeonardetal.,2010,PNAS,107(31):13654-13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸(Artemisinicacid)最高达到100mg/L(Dae-KyunRoetal.,2006,Nature,440:940-943)；目前国内在青蒿素，紫杉醇和丹参酮等药物分子的生物合成方面有相关研究，同时Shang等人利用罗汉果(Siraitiagrosvenorii)中的葫芦二烯醇合酶(SgCBS)来生产葫芦二烯醇，将携带SgCBS人工质粒导入到构建好的三萜前体底盘酵母菌株WD-2091，摇瓶系统生产葫芦二烯醇的得率为82.89mg/L。雪胆素与绝大多数葫芦素化合物相似，是一种高度氧化的四环三萜化合物，生物合成途径主要通过甲羟戊酸代谢途径合成。即以乙酰辅酶A为原料合成异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)的一条代谢途径。随后，角鲨烯在鲨烯环氧酶(Squaleneepoxidase，SE)进一步的催化作用下形成2,3-氧化鲨烯。最后2,3-氧化鲨烯在葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienolsynthase,CBS)一种氧化鲨烯环化酶(OSC)作用下，形成葫芦素的三萜碳骨架葫芦二烯醇(Cuol)，之后再经细胞色素CYP450酶和乙酰基转移酶(BAHD-AT)等经过一系列的结构修饰后，衍生出更多的葫芦素终产物。目前，葫芦素生物合成途径仍然不清楚，存在很多氧化修饰催化酶基因没被挖掘鉴定出来，其中主要包括氧化还原酶，比如CYP450酶、短链脱氢酶等。要搞清这些活性葫芦素化合物的生物合成途径，必须鉴定这些途径中相关的关键酶基因。然而，发掘和鉴定葫芦素后期作用酶基因需要有足够的催化前体葫芦二烯醇，这严重影响了葫芦素途径后期作用酶的挖掘鉴定。因此，迫切需要构建生产葫芦二烯醇(Cuol)的酿酒酵母底盘细胞成为研究葫芦素生物合成途径的关键环节，为解析完整葫芦素生物合成途径和工厂化生产葫芦素单体奠定了重要基础。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol01、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用，为雪胆甲素及葫芦素的生物合成提供了足够的中间体。为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：一种含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法，包括以下步骤：S1、将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径的相关基因ERG20、ERG9、tHMG1和来源于植物中华雪胆中编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6以及细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块；S2、运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2，形成含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母工程菌Cuol01。作为优选，所述酿酒酵母工程菌Cuol01提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子HXT7p、TEF2p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t控制tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9和HcOSC6基因的表达，即生产葫芦二烯醇途径的下游模块。作为优选，所述酿酒酵母工程菌Cuol01提供的基因表达盒的构建方法中的筛选标记基因为LEU2。本专利技术还提供了一种由上述的构建方法构建得到的酿酒酵母重组菌Cuol01。本专利技术还提供了一种含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol02的构建方法，包括以下步骤：将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径上游模块的相关基因ERG12、ERG13、ERG8、ERG19、ERG10、IDI、tHMG1分别构建形成基因表达盒，然后运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母工程菌Cuol01中的YPRCδ15DNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因HIS3，形成强化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径代谢通量，同时含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol02。作为优选，所述酿酒酵母工程菌Cuol02提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子ENO2p、TEF2p、GPM1p、TPI1p、PGK3p、TEF1p、TDH3p和终止子CPS1t、IDP1t、HIS5t、PRM5t、PRM9t、ADH1t、SPG5t控制ERG12、ERG13、ERG19、ERG8、IDI、tHMG1和ERG10基因的表达，即强化甲羟戊酸途径的上游模块。作为优选，所述酿酒酵母工程菌Cuol02提供的基因表达盒的构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径的相关基因ERG20、ERG9、tHMG1和来源于植物中华雪胆中编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6以及细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块；/nS2、运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2，形成含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母工程菌Cuol01；/n其中，所述酿酒酵母工程菌Cuol01提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子HXT7p、TEF2 p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t控制tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9和HcOSC6基因的表达，即生产葫芦二烯醇途径的下游模块。/n

【技术特征摘要】
1.酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径的相关基因ERG20、ERG9、tHMG1和来源于植物中华雪胆中编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6以及细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块；
S2、运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2，形成含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母工程菌Cuol01；
其中，所述酿酒酵母工程菌Cuol01提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子HXT7p、TEF2p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t控制tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9和HcOSC6基因的表达，即生产葫芦二烯醇途径的下游模块。


2.如权利要求1所述的酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌Cuol01提供的基因表达盒的构建方法中的筛选标记基因为LEU2，序列为SEQIDNo.103。


3.一种由权利要求1～2任一所述的构建方法构建得到的酿酒酵母重组菌Cuol01。


4.酿酒酵母重组菌Cuol02的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径上游模块的相关基因ERG12、ERG13、ERG8、ERG19、ERG10、IDI、tHMG1分别构建形成基因表达盒，然后运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母工程菌Cuol01中的YPRCδ15DNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因HIS3，形成强化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径代谢通量，同时含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌Cuol02；
其中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈庚，张广辉，杨生超，郭兆宽，王益娜，和四梅，段绍凤，赵艳，林源，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53