目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法。所述目的基因多拷贝整合的方法包括(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株；(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板；(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体。本发明专利技术将CRISPR‑Cas9系统编辑基因组的高效性和rDNA重复单元的多拷贝特点相结合首次在酵母细胞中建立了能够同时在基因组上整合高达10余个拷贝目的基因的方法。

【技术实现步骤摘要】
目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法本申请是分案申请，其母案是专利技术名称为“目的基因多拷贝整合的方法、重组菌、白藜芦醇以及重组人血清白蛋白的制备方法”的专利技术专利申请，其申请号为201810054262.4，申请日为2018年01月19日。
本专利技术总地涉及生物
，具体来说涉及目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法。
技术介绍
酵母是一种单细胞真核生物，其作为表达系统，具有以下优势：具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后修饰系统，利于外源蛋白的稳定高效表达；是生物安全性微生物，不产生内毒素，合成的生物产品具有很高的安全性。目前，酵母已广泛用于生物制剂的合成，如酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、汉逊酵母Hansenulapolymorpha、毕赤酵母Pichiapastoris等。汉逊酵母作为甲醇型酵母的模式菌株，在基础研究和工业应用领域发挥着重要作用。作为生产多种重要生物制剂的微生物细胞工厂，汉逊酵母具有高效、安全和经济等诸多优势，主要体现在以下几个方面：1)易于目的基因的高拷贝整合，通过非同源末端连接机制能够随机整合超过100个拷贝的目的基因，易于实现外源蛋白的高效表达；2)是生物安全性微生物(GRAS)，其蛋白糖基化水平与哺乳动物细胞相近，使得汉逊酵母生产的蛋白制剂具有较高的生物安全性；3)是最耐热的酵母，最高生长温度可以达到50℃，由此可以降低工业发酵的冷凝成本，适合大规模工业生产。然而，汉逊酵母缺少稳定的表达质粒，因此，需要通过在基因组上稳定整合目的基因。酿酒酵母是一种具有生物安全性的模式真核生物，其遗传背景清晰，发酵方法成熟，已被广泛应用于多种生物制剂的合成，如青蒿素、紫杉醇、人参皂苷、番茄红素和β-胡萝卜素等。rDNA是指细胞核中编码核糖体RNA的DNA序列。在酵母细胞中一般存在高拷贝的rDNA单元(也被称作rDNA重复单元)串联重复，所有rDNA单元相同，均由两个转录区5S和35SrDNA序列以及两个非转录区NTS1和NTS2组成。如在汉逊酵母中(图1),大约50～60个rDNA单元在II号染色体上串联重复，一个rDNA单元长达8kb左右；在酿酒酵母中，大约150～200个rDNA单元在第Ⅻ号染色体上串联重复，每个rDNA单元长达9.1kb左右。将rDNA作为整合位点以提高目的基因整合拷贝数的应用策略在多种酵母中均已展开研究，但其整合稳定性很难控制，目的基因的拷贝数会随着酵母繁殖世代的增加而减小或表达量降低，有研究指出目的基因的稳定性与整合载体的大小有关，即整合载体的大小不能超过rDNA单元的大小。此外，目前文献报道的高拷贝整合目的基因的方法，一般均需采用遗传标记基因以指示目的基因是否整合至宿主细胞。因此在整合目的基因的同时，不可避免地在宿主细胞的基因组上整合多拷贝的遗传标记基因。尤其是在整合多个不同目的基因时，还需要选择多个不同的遗传标记基因以指示不同的目的基因。这样不但影响后续的遗传操作，而且带有遗传标记基因的菌株，尤其是带有抗生素抗性基因的菌株还可能存在生物安全性问题。目的基因CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种抵御外援DNA入侵的免疫防御系统。CRISPR是指规律成簇间隔短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)；而Cas是指CRISPR相关蛋白(CRISPR-associatedproteins,Cas)，是一种核酸酶，能剪切双链DNA。目前，已发现了三种类型的CRISPR/Cas系统。其中，II型的CRISPR/Cas9系统发挥作用只需Cas9蛋白和引导Cas9的gRNA两种成分，gRNA包含crRNA和tracrRNA两部分。tracrRNA形成发卡型二级结构，与Cas9蛋白相结合形成Cas9-gRNA复合体；crRNA含有20个碱基的向导序列(N20)，该20个碱基与靶位点DNA的序列互补，并介导Cas9-gRNA复合体特异性识别和结合靶位点DNA。该复合体与靶位点DNA结合后，Cas9发挥核酸酶的功能切割双链DNA，造成双链DNA断裂(DSB)。细胞利用同源重组(HR)或非同源末端连接机制(NHEJ)修复DSB，实现基因组编辑。白藜芦醇是一种具有较高生物活性的天然多酚类物质，主要来源于葡萄、虎杖及桑椹等植物。作为一种天然的抗氧化剂，白藜芦醇具有广泛的药理作用：对肝癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤细胞产生不同程度的抑制作用；促进血管舒张，防治冠状动脉粥样硬化；减少细胞因子生成量，抑制炎症的发生。基于其重要的生理作用，白藜芦醇被广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。目前，白藜芦醇的生产方法是植物提取，但因植物中白藜芦醇的含量低、植物生长周期长等而成本较高。相比之下，微生物发酵法具有工艺简单、不受气候等环境条件的影响、生产成本低、周期短、污染少的诸多优势。白藜芦醇的生物合成途径如图3所示，可以以酪氨酸为底物，酪氨酸解氨酶(TAL)催化生成4-香豆酸，再经4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、芪合酶(STS)，最终生成白藜芦醇；也可以以苯丙氨酸为底物，苯丙氨酸氨解酶(PAL)催化生成桂皮酸，经肉桂酸-4-羟化酶(C4H)催化生成4-香豆酸，再经4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、芪合酶(STS)，最终生成白藜芦醇。由于C4H属于P450酶系，很难在微生物中实现异源表达，因此研究较多的是以酪氨酸为底物的代谢途径。目前白藜芦醇重组工程菌株的构建多使用大肠杆菌或酿酒酵母，虽然众多的研究结果显示表达相同的基因大肠杆菌产量约为酵母的3倍左右，但酵母在生物安全方面的优势是大肠杆菌不可比拟的。所以，如何采用酵母获得产量较高的白藜芦醇成为现在亟需解决的技术问题。人血清白蛋白(humanserumalbumin，HSA)是血液系统的重要组成部分，具有结合、运输物质，维持血液渗透压，清除自由基，抗凝血等功能。在临床上广泛应用于高胆红素血症、白细胞增多症、人血清白蛋白过少症、以及呼吸窘迫综合征等多种疾病的治疗。因此，HSA是现代医学中临床用量最大的重要的生物制剂。血浆来源的人血清白蛋白存在HIV、HBV等多种病毒传播的风险，相比之下，应用生物工程合成的重组人血清白蛋白从根源上避免了病毒的污染，具有很高的安全性。尽管已经在酵母等菌株中成功表达过人血清白蛋白，但表达的效率以及表达的规模仍然不够理想。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供目的基因多拷贝整合的方法、重组菌、白藜芦醇以及重组人血清白蛋白的制备方法本专利技术提供了一种介导目的基因在酵母中多拷贝整合的方法，其中，包括：(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株；(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板；(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体。优选地，根据前述的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种介导目的基因在酵母中多拷贝整合的方法，其特征在于，包括：/n(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株；/n(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；/n(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板，所述目的基因为编码人血清白蛋白基因HSA，所述HSA如序列表中序列20所示；/n(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种介导目的基因在酵母中多拷贝整合的方法，其特征在于，包括：
(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株；
(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；
(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板，所述目的基因为编码人血清白蛋白基因HSA，所述HSA如序列表中序列20所示；
(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(A)为将携带Cas9表达盒的表达载体导入所述酵母菌株；或将Cas9表达盒整合至所述酵母菌株的染色体上；
步骤(D)为通过将所述酵母菌株在无筛选压力的培养基中培养进行载体的消除，或通过同源重组将整合至染色体上的所述表达盒替换为染色体上整合位点的原始DNA片段。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(C)后还包括：(E...

【专利技术属性】
技术研发人员：温廷益，王来友，邓爱华，商秀玲，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11