一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术公开的一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法，利用现代分子技术成功优化了玉米醇溶蛋白降解酶的基因序列，构建了能够在酵母体外表达玉米醇溶蛋白降解酶的表达载体pPICZαA‑ZDP，利用该载体和毕赤酵母能够制备玉米醇溶蛋白降解酶，进而为玉米醇溶蛋白降解酶在生产中的应用提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，更具体的说是涉及一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用。
技术介绍
玉米是目前反刍动物饲喂系统中精料的主要成分。淀粉约占玉米干物质的70％，是反刍动物的重要能量来源。反刍动物利用玉米淀粉的重要途径是利用瘤胃微生物对其降解。然而，尽管瘤胃环境较为复杂，存在广泛能够降解淀粉的微生物，但淀粉瘤胃消化率往往低于60％，对于干粉碎玉米通常会低于50％，而我国反刍动物养殖体系中用的最多的恰恰就是干粉碎玉米。瘤胃淀粉消化率不足会抑制瘤胃微生物蛋白合成，进而降低动物的生产性能。因此，提高淀粉的瘤胃消化率是优化淀粉能量供应和提高动物生产的重要举措。影响玉米淀粉瘤胃消化率的因素包括玉米的种类、刈割时间、淀粉组成(直链、支链淀粉比例)、加工方式以及玉米醇溶蛋白含量等。其中，近年来关于玉米中玉米醇溶蛋白含量对反刍动物瘤胃淀粉降解影响的研究备受关注。玉米醇溶蛋白是玉米胚乳中的主要贮存蛋白质，与淀粉颗粒以交联复合体的形式存在，不溶于水、低盐溶液以及瘤胃环境，但可溶于60％～95％的乙醇溶液。玉米醇溶蛋白的瘤胃不溶特性决定了其在瘤胃中很难被微生物降解，进而限制瘤胃微生物与淀粉颗粒的接触，导致淀粉降解性下降。研究显示，玉米醇溶蛋白含量由7.6％增加至9.1％时，瘤胃淀粉有效降解率由61.9％降至46.2％。与此类似，在另外一个研究中，玉米醇溶蛋白含量由3.09％增加到6.04％，体外瘤胃淀粉降解率由62.1％降至52.9％，瘤胃有效降解率则由49.3％降至39.6％，回归统计显示，玉米醇溶蛋白与体外瘤胃淀粉降解率、瘤胃淀粉有效降解率均呈极显著的负相关关系。综上可知，玉米醇溶蛋白对玉米中淀粉的瘤胃消化起显著的抑制作用，寻找降解玉米醇溶蛋白的有效措施，是提高瘤胃淀粉消化率的重要途径。对于如何降解玉米中的玉米醇溶蛋白，目前主要采用对玉米进行加工处理、添加外源酶制剂等措施。对玉米籽粒进行蒸汽压片、青贮发酵处理，可在一定程度上破坏或降解玉米醇溶蛋白，提高淀粉的瘤胃消化率，但存在能耗和成本较高的缺陷；而对玉米籽粒进行青贮发酵主要应用于高水分玉米，该措施不适用于我国当前的畜牧生产环境。一些工业领域尝试利用碱性、中性、酸性蛋白酶、以及微生物发酵复合酶去降解玉米醇溶蛋白，但收效甚微，即使这些酶在最适作用条件下，对玉米醇溶蛋白的降解率也仅为15-33％，这主要是因为，选择的酶在降解玉米醇溶蛋白方面缺乏专一性，这突显出选择玉米醇溶蛋白专一性降解酶的重要性。玉米种子在萌发过程中会动用贮存蛋白以提供胚芽生长所必须的营养物质。研究发现，玉米种子在萌发过程中会通过分泌的专一性玉米醇溶蛋白降解酶(zein-degradingprotease，ZDP)将贮存蛋白(含玉米醇溶蛋白)几乎全部降解。但玉米种子在萌发过程中产生的蛋白成分复杂，且分泌的玉米醇溶蛋白降解酶浓度较低，分离纯化较为困难，这阻碍了它在生产中的进一步应用。因此，提供一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法，具体步骤如下：(1)优化玉米醇溶蛋白降解酶基因；(2)构建重组表达载体pPICZαA-ZDP；(3)将重组表达载体pPICZαA-ZDP转化毕赤酵母，获得阳性克隆，进行培养；(4)将培养的菌液离心，获得培养上清液；进行亲和层析纯化，获得纯化的玉米醇溶蛋白降解酶。进一步，步骤(1)根据毕赤酵母的密码子偏好性和pPICZαA载体特点，对玉米醇溶蛋白降解酶基因进行优化，优化后的玉米醇溶蛋白降解酶基因为SEQIDNO.1。进一步，步骤(2)构建重组表达载体pPICZαA-ZDP的具体步骤如下：利用EcoRI和XbaI限制性内切酶分别对玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和表达质粒pPICZαA进行双酶切；胶回收玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和pPICZαA质粒片段；取玉米醇溶蛋白降解酶目的片段4μl，T4连接酶和缓冲液5μl，纯化的pPICZαA载体1μl混匀，16℃循环水浴孵育过夜；转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，于含Amp的LB培养基中筛选阳性克隆；挑取白色菌落加入到含Amp的液体LB培养基中，37℃震荡过夜培养，待培养基浑浊后，提取重组表达载体质粒pPICZαA-ZDP，并进行酶切验证。进一步，步骤(3)转化毕赤酵母的具体步骤如下：利用限制性内切酶SacI对重组表达载体pPICZαA-ZDP进行酶切，对酶切产物进行纯化；纯化的表达载体pPICZαA-ZDP转入毕赤酵母X33感受态细胞，于含博来霉素的YPD培养基中培养，通过PCR扩增反应筛选阳性克隆；挑取1个阳性克隆白色菌落加入到2mLYPD培养基中，30℃、160rpm震荡过夜培养；将全部菌液转入到200mLBMGY培养基中，30℃震荡过夜培养，用于发酵罐培养。进一步，所述的玉米醇溶蛋白降解酶在水解玉米醇溶蛋白中的应用。进一步，所述的玉米醇溶蛋白降解酶在促进淀粉酶降解玉米淀粉中的应用。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用，利用现代分子技术成功优化了玉米醇溶蛋白降解酶的基因序列，构建了能够在酵母体外表达玉米醇溶蛋白降解酶的表达载体pPICZαA-ZDP，利用该载体和毕赤酵母能够制备玉米醇溶蛋白降解酶，进而为玉米醇溶蛋白降解酶在生产中的应用提供技术支撑。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术重组玉米醇溶蛋白降解酶的SDS-PAGE和Westernblot分析；其中，泳道1、蛋白质marker；泳道2、纯化的玉米醇溶蛋白降解酶SDS-PAGE分析；3、玉米醇溶蛋白降解酶的Westernblot分析；图2附图为本专利技术玉米醇溶蛋白降解酶的最适pH确定；图3附图为本专利技术玉米醇溶蛋白降解酶的最适温度确定；图4附图为本专利技术玉米醇溶蛋白降解酶对商品玉米醇溶蛋白的降解；图5附图为本专利技术对照组干粉碎玉米的扫描电镜图；比例尺大小为20μm；图6附图为本专利技术玉米醇溶蛋白降解酶处理组干粉碎玉米的扫描电镜图；比例尺大小为20μm；图7附图为本专利技术玉米醇溶蛋白降解酶对干粉碎玉米的水解作用；图8附图为本专利技术玉米醇溶蛋白降解酶对淀粉酶降解玉米中淀粉的协同促进作用。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)优化玉米醇溶蛋白降解酶基因；/n(2)构建重组表达载体pPICZαA-ZDP；/n(3)将重组表达载体pPICZαA-ZDP转化毕赤酵母，获得阳性克隆，进行培养；/n(4)将培养的菌液离心，获得培养上清液；进行亲和层析纯化，获得纯化的玉米醇溶蛋白降解酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)优化玉米醇溶蛋白降解酶基因；
(2)构建重组表达载体pPICZαA-ZDP；
(3)将重组表达载体pPICZαA-ZDP转化毕赤酵母，获得阳性克隆，进行培养；
(4)将培养的菌液离心，获得培养上清液；进行亲和层析纯化，获得纯化的玉米醇溶蛋白降解酶。


2.根据权利要求1所述的一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)根据毕赤酵母的密码子偏好性和pPICZαA载体特点，对玉米醇溶蛋白降解酶基因进行优化，优化后的基因片段为SEQIDNO.1。


3.根据权利要求2所述的一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)构建重组表达载体pPICZαA-ZDP的具体步骤如下：利用EcoRI和XbaI限制性内切酶分别对玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和表达质粒pPICZαA进行双酶切；胶回收玉米醇溶蛋白降解酶基因片段和pPICZαA质粒片段；取玉米醇溶蛋白降解酶目的片段4μl，T4连接酶和缓冲液5μl，纯化的pPICZαA载...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵向辉，刘婵娟，瞿明仁，潘珂，李艳娇，张文静，杨竹青，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西;36