利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法，包括如下步骤：1)小浮萍叶状体的预培养；2)目的基因的扩增；3)OMP1基因序列的修饰；4)OMP1基因双元植物表达载体的构建；5)利用基因枪法将pMYC2017‑OMP1质粒载体转入小浮萍中；6)对小浮萍进行选择培养，筛选出OMP1基因表达的小浮萍转化植株。该发明专利技术采用优化得到的适宜于小浮萍特异表达的启动子和信号肽，构建专用双元表达载体，结合利用基因枪的、特有的稳定遗传转化方法将包含疫苗重组蛋白基因的双元表达载体转入小浮萍，获得表达疫苗重组蛋白的转基因株系，实现抗弧菌病疫苗蛋白在小浮萍中的高效表达和积累，并且表达抗弧菌疫苗的小浮萍可作为鱼类饲料或饲料添加剂使用，达到防病、治病效果。

【技术实现步骤摘要】
利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法及应用
本专利技术属于分子生物学与基因工程
，具体涉及一种利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法及应用。
技术介绍
近年来，我国水产养殖业发展迅猛，随着高密度、集约化、大规模水产养殖业的出现，鱼类疾病频繁爆发。水产养殖向高密度、集约化发展的同时，鱼类病害问题日益突出。其中弧菌病害是危害海水养殖鱼类最严重的细菌病害之一。弧菌病是由弧菌属细菌引起的一类细菌性疾病。弧菌是海水环境中普遍存在的一种革兰氏阴性细菌，是海水养殖动物细菌性溃疡病的主要病原菌，该病在全球范围内广泛发生,其暴发性流行不仅给海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的养殖业造成巨大的经济损失,还导致野生的海水鱼类、贝类及甲壳类大量死亡。近几年来，我国的海水养殖病害情况非常严重。据统计，在我国已发现的几十种海水养殖病害中，以弧菌病对海水养殖造成的损失最大，几乎所有海水养殖鱼类都有感染弧菌，如石斑鱼、真鲷、卵形鲳鲹、眼斑拟石首鱼、军曹鱼等均曾患弧菌病。弧菌病严重发生时，鱼类死亡率高达90％以上，每年直接经济损失达数百亿元，给养殖生产带来巨大的经济损失，严重影响了我国海水养殖业的发展。传统防治细菌性病原菌的方法是向水体中或者鱼类饲料中添加抗生素或者直接注射抗生素等方法，这种方法不仅成本高而且由此也带来一系列问题，包括滥用抗生素所造成的药物残留、水产食物残留物鱼类和鱼制品中的残留抗菌剂导致人类的过敏和毒性，抗菌制剂中的化学品及其代谢物的水污染，细菌耐药性等不良后果。因此，弧菌病的防治不得不从以化学药物治疗为主转向免疫预防。但一直以来缺少相应的疫苗用于防控，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。利用小浮萍增殖快、培养简便和鱼类可食等优势，将小浮萍经过改造后建立生物反应器生产医药和生物活性物质，可以表达微生物发酵系统和哺乳动物细胞难以获得的蛋白，如单克隆抗体、细胞调节因子、细胞毒素蛋白和细胞周期蛋白等活性物质和药品。小浮萍生物反应器与动物细胞生物反应器相比，表达的蛋白含量更高，分离纯化更简便，排除了微生物和动物细胞反应器中病原微生物和病毒的感染，省去了对表达产物进行的复杂检测和清除病源微生物的程序，增加了效力，减少了副作用，大大降低了成本。小浮萍生物反应器制药的产品质量、成本和安全方面已显现出优势，并很快得到科学家和生物制药业的认可。有科学家预测，未来5-10年植物将成为临床治疗或诊断药品的主要生产系统，而小浮萍凭借自身的特点将在生物反应器制药方面展现独特的应用优势，具有巨大的开发应用前景。开发小浮萍作为新的药用蛋白生物反应器符合时代需求，对于解决越来越突出的滥用抗生素所造成的药物残留、水产食物残留物鱼类和鱼制品中的残留抗菌剂导致人类的过敏和毒性，抗菌制剂中的化学品及其代谢物的水污染，细菌耐药性等问题有着重要的实际价值。由于小浮萍易于转化并能提供廉价的蛋白质源，因此利用转基因浮萍开发新型疫苗是一种最经济有效的途径,并且具有相当大的潜能。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有原核和真核生物为宿主的生物反应器表达外源蛋白表达量低、可溶性差、无生物活性和不安全等缺点,利用自然水体常见的可食用的小浮萍作为生物反应器,提供了一种利用小浮萍作为生物反应器表达表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)小浮萍叶状体的预培养取状态良好的小浮萍叶状体置于MS培养基上预培养，用于后续基因转化；2)目的基因的扩增提取弧菌基因组总DNA作为模版，并利用PCR反应获得目的基因，即获得PCR产物OMP1基因序列；反应体系的引物:OMP1-F:5′-ATGAAGAAGGTAAGTSNYATTG-3，OMP1-R:5′-TTACCCCCGAGCTTCNRC-3′；3)OMP1基因序列的修饰通过overlapPCR在OMP1基因序列的5’端连接pst1酶切位保护序列、烟草组成型启动子增强序列、Pr1b信号肽序列和Ncol1酶切位接头序列，同时在其3’端连接Sal1保护接头序列、MYC蛋白标签序列、KDEL驻留信号肽序列和BamH1接头保护序列，获得的功能序列修饰的OMP1基因如SEQIDNO.1所示；4)OMP1基因双元植物表达载体的构建将上述得到的功能序列修饰的OMP1基因通过分子克隆组装到植物表达双元载体pMYC2017上，获得植物表达载体pMYC2017-OMP1，采用电转化的方法将该载体转化至大肠杆菌DH5ɑ进行扩增，并从大肠杆菌DH5ɑ中提取和纯化pMYC2017-OMP1载体，得到pMYC2017-OMP1质粒载体；5)利用基因枪法将上述得到的pMYC2017-OMP1质粒载体转入步骤1)培养的小浮萍中；6)对步骤5)得到的小浮萍进行选择培养，并筛选出OMP1基因表达的小浮萍转化植株。进一步的，上述方法还包括步骤7)小浮萍转化植株的鉴定：从最初的小浮萍转化植株中提取总基因组DNA，用PCR验证OMP1基因的存在，来筛选小浮萍转化植株；提取小浮萍转化株系的总RNA，以总RNA为模板，进行RT-PCR鉴定OMP1基因发生转录。进一步的，所述步骤1)中小浮萍叶状体的预培养采用混合营养培养，具体培养条件：MS培养基中添加有机碳源，25～28℃、光周期为14L:10D，光照强度为5000lux。进一步的，所述步骤3)中pst1酶切位保护序列：5’-TGCACTGCAG；烟草组成型启动子增强序列：AATACTAGCCTATTTTATTTCAATTTTAGCTTAAAATCAGCCCCAATTAGCCCCAATTTCAAATTCAAATGGTCCAGCCCAATTCCTAAATAACCCACCCCTAACCCGCCCGGTTTCCCCTTTTGATCCAGGCCG；Pr1b信号肽序列：ATGGGATTTTTTCTCTTTTCACAAATGCCTTCATTTTTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAATAATATCTCACTCTTCCCGTGCC；Ncol1酶切位接头序列：5’–ccatgg；Sal1保护接头序列：5’-GGTGGGTCGAC；MYC蛋白标签序列：5’-gaacagaaactgatctctgaagaagatctg；KDEL驻留信号肽序列：5’-AAGGATGAGCTC；BamH1接头保护序列：5’-GGATCCGCG。进一步的，所述步骤5)中基因枪法进行基因转化的具体过程如下：金粉准备：A、取金粉40mg，放入lmL无水乙醇中，置于1.5mLEppendorf管内；B、于冰上，做超声处理；C、用乙醇洗涤，离心去除乙醇；D、用无菌水洗涤，离心去除无菌水；E、在冰上重复C和D步骤2次；F、加入1mL乙醇或无菌水，使金粉重悬，取出50μL金粉重悬液于1.5mL新Eppen本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)小浮萍叶状体的预培养/n取状态良好的小浮萍叶状体置于MS培养基上预培养，用于后续基因转化；/n2)目的基因的扩增/n提取弧菌基因组总DNA作为模板，并利用PCR反应获得目的基因，即获得PCR产物OMP1基因序列；/n反应体系的引物:OMP1-F:5′-ATGAAGAAGGTAAGTSNYATTG-3，OMP1-R:5′-TTACCCCCGAGCTTCNRC-3′；/n3)OMP1基因序列的修饰/n通过overlap PCR在OMP1基因序列的5’端连接pst1酶切位保护序列、烟草组成型启动子增强序列、Pr1b信号肽序列和Ncol1酶切位接头序列，同时在其3’端连接Sal1保护接头序列、MYC蛋白标签序列、KDEL驻留信号肽序列和BamH1接头保护序列，获得的功能序列修饰的OMP1基因如SEQ ID NO.1所示；/n4)OMP1基因双元植物表达载体的构建/n将上述得到的功能序列修饰的OMP1基因通过分子克隆组装到植物表达双元载体pMYC2017上，获得植物表达载体pMYC2017-OMP1，采用电转化的方法将该载体转化至大肠杆菌DH5ɑ进行扩增，并从大肠杆菌DH5ɑ中提取和纯化pMYC2017-OMP1载体，得到pMYC2017-OMP1质粒载体；/n5)利用基因枪法将上述得到的pMYC2017-OMP1质粒载体转入步骤1)培养的小浮萍中；/n6)对步骤5)得到的小浮萍进行选择培养，并筛选出OMP1基因表达的小浮萍转化植株。/n...

【技术特征摘要】
1.利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)小浮萍叶状体的预培养
取状态良好的小浮萍叶状体置于MS培养基上预培养，用于后续基因转化；
2)目的基因的扩增
提取弧菌基因组总DNA作为模板，并利用PCR反应获得目的基因，即获得PCR产物OMP1基因序列；
反应体系的引物:OMP1-F:5′-ATGAAGAAGGTAAGTSNYATTG-3，OMP1-R:5′-TTACCCCCGAGCTTCNRC-3′；
3)OMP1基因序列的修饰
通过overlapPCR在OMP1基因序列的5’端连接pst1酶切位保护序列、烟草组成型启动子增强序列、Pr1b信号肽序列和Ncol1酶切位接头序列，同时在其3’端连接Sal1保护接头序列、MYC蛋白标签序列、KDEL驻留信号肽序列和BamH1接头保护序列，获得的功能序列修饰的OMP1基因如SEQIDNO.1所示；
4)OMP1基因双元植物表达载体的构建
将上述得到的功能序列修饰的OMP1基因通过分子克隆组装到植物表达双元载体pMYC2017上，获得植物表达载体pMYC2017-OMP1，采用电转化的方法将该载体转化至大肠杆菌DH5ɑ进行扩增，并从大肠杆菌DH5ɑ中提取和纯化pMYC2017-OMP1载体，得到pMYC2017-OMP1质粒载体；
5)利用基因枪法将上述得到的pMYC2017-OMP1质粒载体转入步骤1)培养的小浮萍中；
6)对步骤5)得到的小浮萍进行选择培养，并筛选出OMP1基因表达的小浮萍转化植株。


2.如权利要求1所述的利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法，其特征在于，还包括步骤7)小浮萍转化植株的鉴定：
从最初的小浮萍转化植株中提取总基因组DNA，用PCR验证OMP1基因的存在，来筛选小浮萍转化植株；
提取小浮萍转化株系的总RNA，以总RNA为模板，进行RT-PCR鉴定OMP1基因发生转录。


3.如权利要求1所述的利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法，其特征在于，所述步骤1)中小浮萍叶状体的预培养采用混合营养培养，具体培养条件：MS培养基中添加有机碳源，25～28℃、光周期为14L:10D，光照强度为5000lux。


4.如权利要求1所述的利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法，其特征在于，所述步骤3)中pst1酶切位保护序列：5’-TGCACTGCAG；
烟草组成型启动子增强序列：
AATACTAGCCTATTTTATTTCAATTTTAGCTTAAAATCAGCCCCAATTAGCCCCAATTTCAAATTCAAATGGTCCAGCCCAATTCCTAAATAACCCACCCCTAACCCGCCCGGTTTCCCCTTTTGATCCAGGCCG；
Pr1b信号肽序列：
ATGGGATTTTTTCTCTTTTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯宏伟，杨晶晶，孙作亮，王杰，
申请(专利权)人：青萍湾武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42