孤雌生殖单倍体诱导基因DMP及其应用制造技术

本发明专利技术公开了孤雌生殖单倍体诱导基因DMP及其应用。本发明专利技术从拟南芥中克隆了孤雌生殖单倍体诱导基因AtDMP8和AtDMP9。实验证明，AtDMP8和AtDMP9的突变能够产生孤雌生殖单倍体诱导能力，这使得孤雌生殖方式诱导产生单倍体的应用向双子叶作物上延伸。本发明专利技术又进一步在番茄中进行了验证，在番茄中同样发现SlDMP的突变能够产生孤雌生殖单倍体诱导能力。本发明专利技术为拓宽单倍体育种技术在双子叶植物上应用及揭示孤雌生殖单倍体产生的生物学机理奠定了重要的基础。鉴于目前育种行业中单倍体育种技术利用的广泛性，本发明专利技术具有十分广泛的应用空间和市场前景。

【技术实现步骤摘要】
孤雌生殖单倍体诱导基因DMP及其应用
本专利技术涉及以基因组编辑技术为主的农业生物
和作物遗传育种领域，具体涉及一种植物母本单倍体诱导系的制备方法及其应用，特别涉及一种利用基因编辑技术得到的孤雌生殖单倍体诱导基因DMP突变体作为植物单倍体诱导系在诱导植物产生母本单倍体中的应用。
技术介绍
优良自交系的选育是作物利用杂种优势、选育优良杂交种的基础和关键。但传统选育方法需要7～8个世代才能获得较为稳定的自交系，而单倍体育种技术只需2个世代(WeberDF，2014)，大大缩短了育种的周期。目前，在双子叶作物上单倍体的产生主要依靠的还是花药离体培养，效率低下且对材料的基因型依赖性较高，很难实现规模化的应用。虽然将遗传修饰的着丝粒特异组蛋白CENH3(centromere-specifichistone3variant)导入拟南芥cenh3突变体中可诱导单倍体的产生，但该方式在诱导过程中产生大量的整倍体(Ravi,M,etal,2010)。目前，基因编辑技术的体系已经非常成熟稳定，但受遗传转化对材料和基因型依赖的限制而无法进一步发挥其最大的作用。虽然可通过将基因编辑载体导入某个容易转化的受体材料中，进一步将其与需要编辑的目标杂交而实现编辑(LiCetal.,2017)，但需要经过长时间的回交才能将背景恢复且不能达到100％。将单倍体诱导与基因编辑技术结合实现了对目标材料单倍体基因的编辑而获得纯合的编辑系，极大缩短了及扩宽了单倍体和基因编辑技术的应用范围(Kelliher,Tetal.,2019；Wang,Betal.,2019；Hu,Netal.,2019)。然而，在双子叶植物中由于生物诱导产生单倍体方式的欠缺而无法与基因编辑技术进行结合。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植物单倍体诱导系的制备方法。本专利技术提供的植物单倍体诱导系的制备方法包括如下步骤：沉默或抑制植物基因组中DMP基因的表达和/或活性或敲除DMP基因，得到转基因植物，即为植物单倍体诱导系；所述植物为双子叶植物；所述DMP基因编码的蛋白质为如下(1)或(2)或(3)或(4)所示的蛋白质：(1)氨基酸序列是序列2或序列4或序列6所示的蛋白质；(2)在序列2或序列4或序列6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；(3)将序列2或序列4或序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；(4)与序列2或序列4或序列6所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。上述植物单倍体诱导系的制备方法中，所述双子叶植物为拟南芥时，所述DMP基因为AtDMP8基因和/或AtDMP9基因；所述方法为沉默或抑制拟南芥基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因的表达和/或活性或敲除AtDMP8基因和/或AtDMP9基因，得到转基因拟南芥，即为拟南芥单倍体诱导系；所述双子叶植物为番茄时，所述DMP基因为SlDMP基因；所述方法为沉默或抑制番茄基因组中SlDMP基因或敲除SlDMP基因，得到转基因番茄，即为番茄单倍体诱导系。上述植物单倍体诱导系的制备方法中，所述沉默或抑制拟南芥基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因的表达和/或活性或敲除AtDMP8基因和/或AtDMP9基因为使拟南芥基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因表达量降低或使拟南芥基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换；所述沉默或抑制番茄基因组中SlDMP基因的表达和/或活性或敲除SlDMP基因为使番茄基因组中SlDMP基因表达量降低或使番茄基因组中SlDMP基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换。所述使植物基因组中DMP基因表达量降低的方式可为RNAi干扰或过表达或启动子编辑。所述RNAi干扰可为单链RNA干扰，如miRNA，也可为双链RNA干扰，如siRNA、dsRNA、shRNA等。所述使植物基因组中DMP基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方式可为CRISPR/Cas9或TELLEN或T-DNA插入或EMS诱变。进一步的，所述使植物基因组中DMP基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方式为CRISPR/Cas9。更进一步的，所述拟南芥中，所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列1第98-117位、序列3第290-309位、序列3第368-387位和序列1第509-528位。所述番茄中，所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列5第76-95位和序列5第247-266位。在本专利技术的具体实施例中，所述使植物基因组中DMP基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方法包括如下步骤：将含有所述靶序列的CRISPR/Cas9载体导入植物中，得到转基因植物。所述植物为拟南芥时，所述含有所述靶序列的CRISPR/Cas9载体为将序列7所示的DNA分子(sgRNA表达元件)、序列9所示的DNA分子(Cas9表达元件)和序列10所示的DNA分子(荧光蛋白表达元件)通过goldengate的方法连接到pICSL4723载体后得到的重组载体。所述植物为番茄时，所述含有所述靶序列的CRISPR/Cas9载体为将序列8所示的DNA分子(sgRNA表达元件)、序列11所示的DNA分子(Cas9表达元件)、序列10所示的DNA分子(荧光蛋白表达元件)和序列12所示的DNA分子(NptII表达元件)通过goldengate的方法连接到pICSL4723载体后得到的重组载体。上述植物单倍体诱导系的制备方法还包括筛选DMP基因突变体的步骤。本专利技术的另一个目的是提供一种植物单倍体的制备方法。本专利技术提供的植物单倍体的制备方法包括如下步骤：将由上述方法制备的植物单倍体诱导系或其后代进行自交或者作为父本与其他植物材料杂交，得到自交后代或杂交后代，即为所述植物单倍体；所述植物为双子叶植物。进一步的，上述植物单倍体的制备方法还包括如下步骤：将所述自交后代或所述杂交后代单株进行荧光标记鉴定和/或单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株为植物单倍体。更进一步的，所述荧光标记鉴定方法可按照如下方法进行：在含有所述靶序列的CRISPR/Cas9载体上携带荧光蛋白表达元件(如启动子AtOLEO1驱动TagRFP(Entacmaeaquadricolor)的表达元件)，通过荧光灯对待测植株的荧光信号进行观察：若待测植株无荧光或弱荧光，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株表现出相应荧光，则该植株为或候选为二倍体。所述单倍体性状鉴定方法可按照如下方法进行：若待测植株具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株具有植株高大，叶片宽大，披散，育性正常等特征，则该植株为或候选为二倍体。所述叶片倍性鉴定方法可按照如下方法进行：提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物单倍体诱导系的制备方法，包括如下步骤：沉默或抑制植物基因组中DMP基因的表达和/或活性或敲除DMP基因，得到转基因植物，即为植物单倍体诱导系；所述植物为双子叶植物；/n所述DMP基因编码的蛋白质为如下(1)或(2)或(3)或(4)所示的蛋白质：/n(1)氨基酸序列是序列2或序列4或序列6所示的蛋白质；/n(2)在序列2或序列4或序列6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；/n(3)将序列2或序列4或序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；/n(4)与序列2或序列4或序列6所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
20190527 CN 20191044508231.一种植物单倍体诱导系的制备方法，包括如下步骤：沉默或抑制植物基因组中DMP基因的表达和/或活性或敲除DMP基因，得到转基因植物，即为植物单倍体诱导系；所述植物为双子叶植物；
所述DMP基因编码的蛋白质为如下(1)或(2)或(3)或(4)所示的蛋白质：
(1)氨基酸序列是序列2或序列4或序列6所示的蛋白质；
(2)在序列2或序列4或序列6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
(3)将序列2或序列4或序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
(4)与序列2或序列4或序列6所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥时，所述DMP基因为AtDMP8基因和/或AtDMP9基因；所述方法为沉默或抑制拟南芥基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因的表达和/或活性或敲除AtDMP8基因和/或AtDMP9基因，得到转基因拟南芥，即为拟南芥单倍体诱导系；
或，所述双子叶植物为番茄时，所述DMP基因为SlDMP基因；所述方法为沉默或抑制番茄基因组中SlDMP基因或敲除SlDMP基因，得到转基因番茄，即为番茄单倍体诱导系。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述沉默或抑制拟南芥基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因的表达和/或活性或敲除AtDMP8基因和/或AtDMP9基因为使拟南芥基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因表达量降低或使拟南芥基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换；
或，所述沉默或抑制番茄基因组中SlDMP基因的表达和/或活性或敲除SlDMP基因为使番茄基因组中SlDMP基因表达量降低或使番茄基因组中SlDMP基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述使拟南芥基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换或所述使番茄基因组中SlDMP基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方式均为CRISPR/Cas9。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述拟南芥中，所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列1第98-117位、序列3第290-309位、序列3第368-387位和序列1第509-528位；
或，所述番茄中，所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列5第76-95位和序列5第247-266位。


6.一种植物单倍体的制备方法，包括如下步骤：将由权利要求1-5任一所述的方法制备的植物单倍体诱导系或其后代进行自交或者作为父本与其他植物材料杂交，得到自交后代或杂交后代，即为所述植物单倍体；所述植物为双子叶植物。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将所述自交后代或所述杂交后代单株进行荧光标记鉴定和/或单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株为植物单倍体。


8.如下1)-5)任一种应用：
1)由权利要求1-5任一所述的方法制备得到的植物单倍体诱导系在培育植物单倍体中的应用；
2)沉默或抑制植物基因组中AtDMP8基因和/或AtDMP9基因的表达和/或活性或敲除AtDMP8基因和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈绍江，钟裕，刘晨旭，祁晓龙，李梦然，陈宝建，焦炎炎，刘宗凯，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11