miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提出了一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，miR164a及前体基因它来自于亚洲棉品种Shixiya1，将前体基因插入经改造的棉花叶皱缩病毒(CLCrV)沉默载体系统中，获得亚洲棉CLCrV:miR164a重组表达载体，将重组表达载体转化到农杆菌菌株GV3101中，转染亚洲棉。实验结果表明miR164a负调节棉花对盐的胁迫应答，通过调控植株中miR164a的表达量，可以调控植株应答盐胁迫的能力，从而提高植株抗性。

【技术实现步骤摘要】
miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用
本专利技术属于生物
，涉及miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用。
技术介绍
亚洲棉是重要的天然纤维作物和油料作物之一，具有较高的经济价值，并且是抗旱耐盐先锋。亚洲棉属于非粮食作物，具有一定耐干旱盐碱的能力，亚洲棉是一种主要的栽培亚洲棉和有用的育种资源，具有很强的遗传稳定性和对一系列胁迫的良好抗性。随着全球气候变化，许多环境因素(如养分流失、土壤盐渍化和温室效应)严重制约农业产业的发展。其中，盐胁迫是植物生长和发育的主要威胁。每年，它都会在世界范围内造成亚洲棉纤维和种子产量的巨大损失。包括亚洲棉在内的植物已经进化出对应的反应和调节机制，以避免或抵抗外源胁迫。miRNAs被转录并切割成一系列保守的小的非编码RNA，通常长度为18-22个核苷酸(Nt)。它们可以结合到下游的靶基因的mRNA上，通过翻译抑制或切割来转录后调节它们的表达。已有大量文献报道miRNA参与植物应答干旱、冷、热、ABA处理，紫外处理等多种胁迫应答过程，例如miR319，miR396c，miR394参与植物应答盐胁迫。陆地棉中一个新发现的miRNA，通过调控靶标CHR基因来响应盐胁迫。研究miRNAs调控植物耐盐将有助于理解亚洲棉中逆境响应miRNAs的动态特征和生物学功能，为亚洲棉育种提供更多的分子和机理数据。研究植物耐盐相关的功能基因对于提高植物耐盐性，降低盐胁下的产量的损失，对造福农业生产有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提出一种miR164a及miR164a前序基因在应答亚洲棉耐盐中的应用，通过调控miR164a的表达量可用于调控目的植物应答盐胁迫的能力，从而提高植株抗性。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，所述miR164a的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。进一步地，通过调控所述miR164a在亚洲棉中的表达量负调控亚洲棉耐盐碱能力。进一步地，所述miR164a的前序基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。进一步地，将所述miR164a的前序基因用限制性内切酶SpeI和AscI双酶切，连接到亚洲棉叶皱缩病毒的pCLCrVA中，得到重组表达载体。进一步地，将所述重组表达载体转入农杆菌中，再将农杆菌转化至亚洲棉植株。一种miR164a培育耐盐碱植物品种的方法，通过调控miR164a在植物中的表达量负调控植物耐盐碱的能力，所述植物为双子叶植物。本专利技术的工作原理及有益效果为：1、本专利技术提供了一种亚洲棉miRNA，即miR164a、以及其前体序列，通过调控该miRNA的表达量可用于调控目的植物应答盐胁迫的能力，表现为盐胁迫下48小时后所述转基因植物的叶片出现萎蔫，且相对电导率高于野生型植株，可见利用亚洲棉miRNA进行作物的遗传转化可培育耐盐作物，进而可提高农作物产量，本专利技术为调控目的植物应答盐胁迫的能力提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。2、本专利技术提供的miR164a，它来自于亚洲棉品种Shixiya1，将亚洲棉幼苗根采用150mMNaCl处理3小时之后，使用Trizol法提取根组织总RNA，以U6snRNA为内参照的miRNA表达测定，使用Primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)设计引物，利用qRT-PCR分析miR164a在亚洲棉的根中的表达量，发现miR164a表达量下降，可见miR164a参与盐胁迫应答。3、本专利技术通过miRBase数据库(http：//www.mirbase.org/)查找亚洲棉miR164a的前体基因序列，然后人工合成，将前体基因插入经改造的亚洲棉叶皱缩病毒(CLCrV)沉默载体系统中，获得亚洲棉CLCrV：miR164a重组表达载体，将重组表达载体转化到农杆菌菌株GV3101中，转染亚洲棉种子。种子发芽后，采用300mMNaCl溶液浇灌处理48小时，利用qRT-PCR分析，发现miR164a在感染CLCrV：miR164a的亚洲棉植株中的表达量显著高于感染CLCrV：00(未插入前体基因的空载体)的植株，说明miR164a在感染了CLCrV：miR164a重组表达载体的亚洲棉中过表达。通过表型鉴定和相对电导率的测定，发现感染CLCrV：miR164a重组表达载体的亚洲棉叶片出现萎蔫，并且叶片相对电导率显著升高，可见miR164a负调节亚洲棉对盐的胁迫应答，通过调控植株中miR164a的表达量，调控植株应答盐胁迫的能力，从而能够提高植株抗性。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1为150mMNaCl处理3小时之后，miR164a在实验组和对照组根组织中的表达量。图2为亚洲棉叶皱缩病毒(CLCrV)沉默载体的基因组结构示意图；亚洲棉叶皱缩病毒是双组份的双生蛋白，pCLCrVA和pCLCrVB是该病毒的两个组分；其中，AC1、AC2、AC3和AC4都是pCLCrVA的编码蛋白，pre-miRNA代表插入的miRNA前体序列，AC1是外壳蛋白，AC2是转录激活蛋白，AC3是复制增强蛋白，AC4功能不明确；BV1和BC1是pCLCrVB的编码蛋白，其中BV1是核穿梭蛋白，BC1是编码运动蛋白；CR表示基因共同区域；LB和RB分别代表T-DNA的左臂和右臂。图3为300mMNaCl处理48小时后，感染空载体CLCrV：00和CLCrV：miR164a的植株叶片中miR164a表达情况的qRT-PCR鉴定结果。图4为300mMNaCl处理48小时后，感染空载体CLCrV：00和CLCrV：miR164a的植株的表型照片。图5为300mMNaCl处理48小时后，感染空载体CLCrV：00和CLCrV：miR164a的植株离体叶片中相对电导率的检测结果。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。下述实施例中300mMNaCl，表示300毫摩尔/升，就是0.3摩尔/升，M表示“摩尔/升；ddH2O指双蒸水(doubledistilled)；亚洲棉Shixiya1品种有棉花研究所种质资源库提供。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1miR164a响应亚洲棉应答盐胁迫1、植株培养及胁迫处理将亚洲棉Shixiya1(SXY1)品种的种子在80℃水中浸泡2h，在培养皿培养1day后发芽；培养至芽露白，移入40目石英砂中培养5day；待苗长到6-10cm，两片子叶完全展开后，转移到营养液进行水培18day，营养液配方如表1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，其特征在于，所述miR164a的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，其特征在于，所述miR164a的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。


2.根据权利要求1所述的一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，其特征在于，通过调控所述miR164a在亚洲棉中的表达量负调控亚洲棉耐盐碱能力。


3.根据权利要求1所述的一种miR164a在应答亚洲棉耐盐中的应用，其特征在于，所述miR164a的前序基因的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛晓阳，李付广，苏震，徐文英，达玲玲，詹晶晶，姚冬霞，张力圩，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，中国农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41