一种转基因抗虫豇豆的培育方法技术

本发明专利技术涉及一种转基因抗虫豇豆的培育方法，其包括如下步骤：获取豇豆无菌子叶节；构建含pUBI、Cry1C*基因的质粒，其中，所述pUBI的序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQ ID NO:2所示；利用携带含pUBI、Cry1C*基因的质粒的农杆菌浸染豇豆无菌子叶节，诱导形成愈伤组织，分化出不定芽，生根，长成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆植株；采用转基因豇豆植株自交，获得纯合的转基因豇豆品种。该培育方法能够培育出抗螟鳞翅目害虫的转基因抗虫豇豆品种。

【技术实现步骤摘要】
一种转基因抗虫豇豆的培育方法
本专利技术涉及植物
，尤其涉及一种转基因抗虫豇豆的培育方法。
技术介绍
豇豆(Vignaunguiculata(L.)Walp.)是豆科豇豆属的一年生蔬菜作物，具有极高的营养价值。豇豆荚螟(Marubatestulalis)，为螟鳞翅目害虫，是豇豆生产中的主要害虫之一，主要危害豆荚，严重影响着豇豆的产量和外观等品质。然而，目前，市场上并没有出现抗豇豆荚螟等害虫的豇豆品种或种质材料。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种转基因抗虫豇豆的培育方法，以获得具有抗螟鳞翅目害虫的转基因豇豆品种。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种转基因抗虫豇豆的培育方法，包括如下步骤：获取豇豆无菌子叶节；构建含pUBI、Cry1C*基因的质粒，其中，所述pUBI的序列如SEQIDNO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQIDNO:2所示；利用携带所述含pUBI、Cry1C*基因的质粒的农杆菌浸染豇豆无菌子叶节，诱导形成愈伤组织，分化出不定芽，诱导生根，长成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆组织、不定芽、根或植株(转基因植株的筛选可以在细胞阶段、愈伤组织阶段、不定芽阶段、生根阶段和植株阶段的任一阶段)；采用转基因豇豆植株自交，获得纯合的转基因豇豆品种。在其中一个实施例中，以序列如SEQIDNO:3所示的pUBI-Fw和序列如SEQIDNO:4所示的Cry1C*-Rv为引物，利用PCR法筛选。>在其中一个实施例中，所述PCR的反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，变性、退火、延伸重复34个循环，最后72℃延伸5min，16℃孵育10min。在其中一个实施例中，所述的转基因抗虫豇豆的培育方法还包括以序列如SEQIDNO:5所示的Cry1C*-Q-Fw和序列如SEQIDNO:6所示的Cry1C*-Q-Rv为引物、采用Q-PCR法鉴定Cry1C*基因在转基因豇豆植株体内表达情况的步骤。在其中一个实施例中，所述Q-PCR的反应程序如下：首先，50℃预热2min，95℃预变性10min；其次，95℃变性15s,58℃退火20s，72℃延伸20s，循环40次；最后，融合曲线95℃运行15s，60℃1min，95℃15s。在其中一个实施例中，所述豇豆为金福临门或武蔬白豇或小仁白子或春宝1号或武蔬4号或武蔬3号。在其中一个实施例中，所述豇豆为蔬4号、金福临门或武蔬3号。在其中一个实施例中，诱导形成愈伤组织所采用的培养条件为：采用MS固体培养基，黑暗条件下26±2℃培养，所述MS固体培养基中的有机成分为维生素B5。在其中一个实施例中，分化出不定芽所采用的培养条件为：采用添加了200mg/mL特美汀的MS固体培养基，26±2℃条件下16小时光照、8小时黑暗条件下依次交替培养，所述MS固体培养基中的有机成分为维生素B5、6-苄氨基嘌呤和激动素。在其中一个实施例中，所述生根所采用的培养条件为：采用添加了0.5mg/LIBA(异丁醇)和50-100mg/L特美汀的固体MS培养基，26±2℃条件下16小时光照、8小时黑暗条件下依次交替培养。本专利技术还提供了利用上述方法培育得到的转基因抗虫豇豆品种。本专利技术的有益效果是：与现有技术相比，本专利技术利用携带所述含pUBI、Cry1C*基因的质粒的农杆菌浸染豇豆的无菌子叶节，再诱导形成生成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆植株，采用转基因豇豆植株自交，得纯合的转基因豇豆品种。本专利技术的转基因抗虫豇豆的培育方法能够获得具有抗螟鳞翅目害虫的转基因豇豆品种，具有重要的实践价值。附图说明图1为实施例1中豇豆外植体的再生情况统计图；其中，图a为再生一个月后各外植体的照片，图b为不同外植体的再生率统计图；图2为实施例2中抗生素特美汀浓度对脱菌情况及再生率影响的统计图；其中，图a为抗生素特美汀浓度对脱菌情况及再生率影响的照片(浓度分别为：左上0mg/L，右上100mg/L，左下200mg/L，右下300mg/L)，图b为特美汀浓度对脱菌情况的影响关系图，图c为培养基中特美汀的浓度对再生率的影响关系图；图3为实施例3中抗生素特美汀浓度对生根的影响的统计图；其中，图a为特美汀浓度对于脱菌的影响关系图；图b为特美汀浓度对于生根率的影响关系图；图4为实施例4中农杆菌浸染浓度对豇豆子叶节再生率的影响统计图；其中，图a对应武蔬4号，图b对应金福临门，图c对应小仁白子，图d对应武蔬3号，OD600×10-1为纵坐标轴；图5为实施例5中的Bt质粒pCAMBIA1300(Cry1C*)及酶切图谱；图6为实施例5中所获得的小白仁子转基因豇豆株系实物照片；图7为实施例5中所获得的春宝1号的转基因豇豆株系实物株系实物照片；图8为实施例5中针对豇豆小仁白子转基因植株的电泳条带检测图；其中，泳道a为marker，泳道b为水(阴性对照)，泳道c为农杆菌质粒(阳性对照)，泳道d、e均为未转化小仁白子豇豆植株，泳道f、g分别为小仁白子转基因待检植株1、2号；图9为实施例5中针对武蔬3号、金福临门转基因植株的电泳条带检测图；其中，泳道a为Marker，泳道b为农杆菌质粒(阳性对照)，泳道c为未转化植株(阴性对照)，泳道d-m为武蔬3号转基因待检植株1-10号，泳道n为金福临门转基因待检植株1号；图10为实施例5中针对春宝1号、金福临门转基因植株的电泳条带检测图；其中，泳道M为Marker，泳道J2-J16为金福临门转基因系，泳道C1-C4为春宝1号转基因系，泳道H2O为阴性对照泳道；图11为实施例5中小仁白子1号转基因植株内的Cry1C*基因序列与质粒载体DNA的序列的测序比对图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术在筛选基因时，基于Cry1C*基因的抗虫性，通过试验将其导入到豇豆中，意外的发现获得了一定的效果，因此选择了上述基因作为目标基因。经过专利技术人大量的实验后，发现采用pUBI作为启动子，将Cry1C*基因通过质粒构建，并利用携带含pUBI、Cry1C*基因质粒的农杆菌浸染豇豆无菌子叶节，诱导形成愈伤组织，分化出不定芽，诱导生根，长成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆组织、不定芽、根或植株的方式培育出的豇豆植株品种，能够具有较佳的抗虫性。专利技术人在实验过程中，还发现转化成功后的转基因植株在进行种植时，其同样会出现基因丢失现象，且不同的豇豆品种出现该现象的概率也不同，其中转化成功率最高的春宝1号其抗性最佳且出现基因丢失的植株占比最少。本专利技术中所用的培养基如下：LCM农杆菌悬浮液(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：/n获取豇豆无菌子叶节；/n构建含pUBI、Cry1C*基因的质粒，其中，所述pUBI的序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQ ID NO:2所示；/n利用携带含所述pUBI、Cry1C*基因质粒的农杆菌浸染豇豆无菌子叶节，诱导形成愈伤组织，分化出不定芽，诱导生根，长成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆组织、不定芽、根或植株；/n将转基因豇豆植株自交，获得纯合的转基因豇豆品种。/n

【技术特征摘要】
20191017 CN 20191099045741.一种转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取豇豆无菌子叶节；
构建含pUBI、Cry1C*基因的质粒，其中，所述pUBI的序列如SEQIDNO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQIDNO:2所示；
利用携带含所述pUBI、Cry1C*基因质粒的农杆菌浸染豇豆无菌子叶节，诱导形成愈伤组织，分化出不定芽，诱导生根，长成豇豆植株，从中筛选含Cry1C*基因的转基因豇豆组织、不定芽、根或植株；
将转基因豇豆植株自交，获得纯合的转基因豇豆品种。


2.根据权利要求1所述的方法转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，以序列如SEQIDNO:3所示的pUBI-Fw和序列如SEQIDNO:4所示的Cry1C*-Rv为引物，利用PCR法筛选。


3.根据权利要求2所述的转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，所述PCR的反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，变性、退火、延伸重复34个循环，最后72℃延伸5min，16℃孵育10min。


4.根据权利要求1所述的转基因抗虫豇豆的培育方法，其特征在于，还包括以序列如SEQIDNO:5所示的Cry1C*-Q-Fw和序列如SEQIDNO:6所示的Cry1C*-Q-Rv为引物、采用Q-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李汉霞，叶志彪，王文乾，张余洋，欧阳波，张俊红，王涛涛，杨长宪，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42