干扰柑橘木虱卵黄蛋白原基因表达的转基因生防真菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体及其制备方法和应用，所述RNAi载体包括骨架载体和发夹结构，所述发夹结构为ihpRNA表达盒，所述ihpRNA表达盒的结构为PtrpC启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+TtrpC终止子结构，所述目的基因片段为柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列DcVg1a或DcVg1b；所述骨架载体为丝状真菌表达载体。还公开一种转基因生防真菌及其制备方法和应用，所述转基因生防真菌是采用所述的RNAi载体转化生防真菌得到。得到的转基因渐狭蜡蚧菌经实验证实可有效提高其对柑橘木虱毒力的毒力，缩短对木虱的浸染时间。

【技术实现步骤摘要】
干扰柑橘木虱卵黄蛋白原基因表达的转基因生防真菌及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程及害虫防治
，具体涉及一种干扰柑橘木虱卵黄蛋白原基因表达的转基因生防真菌及其制备方法和应用。
技术介绍
柑橘黄龙病是毁灭性柑橘病害，柑橘木虱(DiaphorinacitriKuwayama)是柑橘黄龙病最为重要的传播媒介，防治柑橘木虱是控制柑橘黄龙病的关键措施。目前，化学防治仍然是柑橘木虱防控中的主要手段，但化学防治极易造成农药残留、环境污染、害虫抗药性等问题。生物防治是克服化学防治缺点的重要补充途径，微生物(丝状真菌)防治是生物防治的一个重要途径，它主要是利用昆虫病原真菌对害虫进行侵染，穿透其体壁并在其体内萌发生长，最终导致其死亡的一种防治方式。渐狭蜡蚧菌Lecanicilliumattenuatum是一种重要的生防真菌，对柑橘木虱具有控制作用，渐狭蜡蚧菌可以寄生蚜虫、粉虱、木虱、线虫等害虫(螨)以及一些植物病原菌，可是目前对该菌的研究较少。渐狭蜡蚧菌天然菌株浸染害虫速度慢，实际防治效果不太理想，因此，需要对渐狭蜡蚧菌进行遗传改良，提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体，包括骨架载体和发夹结构，其特征在于：所述发夹结构为ihpRNA表达盒，所述ihpRNA表达盒的结构为PtrpC启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+TtrpC终止子结构，所述目的基因片段为柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列DcVg1a或DcVg1b；所述骨架载体为丝状真菌表达载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体，包括骨架载体和发夹结构，其特征在于：所述发夹结构为ihpRNA表达盒，所述ihpRNA表达盒的结构为PtrpC启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+TtrpC终止子结构，所述目的基因片段为柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列DcVg1a或DcVg1b；所述骨架载体为丝状真菌表达载体。


2.如权利要求1所述的柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体，其特征在于：所述丝状真菌表达载体是利用PdmⅠ或者XmnⅠ、和PstⅠ2种酶对pRCy1载体进行酶切，获得含有HygR、intron片段的线性载体，再利用重组位点将PtrpC启动子+EGFP片段连入pRCy1线性载体中得到的。


3.如权利要求2所述的柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体的构建方法，其特征在于：采用一步克隆法将PtrpC启动子+EGFP基因片段连接到丝状真菌表达载体pRCy1中获得pRCy3，用一步克隆法将目的基因的正向片段转入pRCy3载体启动子和intron之间，然后用一步克隆法转入反向片段，即得。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PtrpC启动子+EGFP基因片段是以pRCy2a为模板，设计含有XmnⅠ和PstⅠ酶酶切位点的引物，进行PCR扩增得到；
利用PdmⅠ或者XmnⅠ、和PstⅠ2种酶对pRCy1载体进行酶切获得线性载体，利用重组位点用一步克隆法将得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：冉春，杨娟生，于士将，丛林，刘浩强，李鸿筠，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50