干扰柑橘木虱卵黄蛋白原基因表达的转基因生防真菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体及其制备方法和应用，所述RNAi载体包括骨架载体和发夹结构，所述发夹结构为ihpRNA表达盒，所述ihpRNA表达盒的结构为PtrpC启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+TtrpC终止子结构，所述目的基因片段为柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列DcVg1a或DcVg1b；所述骨架载体为丝状真菌表达载体。还公开一种转基因生防真菌及其制备方法和应用，所述转基因生防真菌是采用所述的RNAi载体转化生防真菌得到。得到的转基因渐狭蜡蚧菌经实验证实可有效提高其对柑橘木虱毒力的毒力，缩短对木虱的浸染时间。

【技术实现步骤摘要】
干扰柑橘木虱卵黄蛋白原基因表达的转基因生防真菌及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程及害虫防治
，具体涉及一种干扰柑橘木虱卵黄蛋白原基因表达的转基因生防真菌及其制备方法和应用。
技术介绍
柑橘黄龙病是毁灭性柑橘病害，柑橘木虱(DiaphorinacitriKuwayama)是柑橘黄龙病最为重要的传播媒介，防治柑橘木虱是控制柑橘黄龙病的关键措施。目前，化学防治仍然是柑橘木虱防控中的主要手段，但化学防治极易造成农药残留、环境污染、害虫抗药性等问题。生物防治是克服化学防治缺点的重要补充途径，微生物(丝状真菌)防治是生物防治的一个重要途径，它主要是利用昆虫病原真菌对害虫进行侵染，穿透其体壁并在其体内萌发生长，最终导致其死亡的一种防治方式。渐狭蜡蚧菌Lecanicilliumattenuatum是一种重要的生防真菌，对柑橘木虱具有控制作用，渐狭蜡蚧菌可以寄生蚜虫、粉虱、木虱、线虫等害虫(螨)以及一些植物病原菌，可是目前对该菌的研究较少。渐狭蜡蚧菌天然菌株浸染害虫速度慢，实际防治效果不太理想，因此，需要对渐狭蜡蚧菌进行遗传改良，提高其对柑橘木虱的毒力。卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)几乎是所有卵生动物卵黄蛋白(vitellin，Vn)的前体，它普遍存在于卵生非哺乳类性成熟动物的血液中，参与卵生动物的发育和生殖等过程。RNA干扰(RNAinterfere,RNAi)是由同源的dsRNA介导的转录后基因沉默现象。在昆虫RNAi的研究应用中，直接注射dsRNA、饲喂dsRNA和构建RNAi载体是目前使用RNAi技术的主要方法。目前对于利用真菌作为媒介干扰害虫(螨)的研究很少，对这些昆虫的干扰研究主要集中在含有昆虫靶基因dsRNA的转基因植物中。在很多转基因的植物中都取得了成功，起到了很好防治昆虫的作用，Mao等人就通过转棉铃虫P450基因到植物中，使得对该虫有了一个良好的控制效应(Maoetal.,2007)。但是也有转入的基因不执行RNAi功能，张凤珍就将褐飞虱的基因转入水稻中，但是并没有发现对褐飞虱有RNAi效应(张凤珍，2013)。在实验中，对于RANi不执行其功能的原因很多，不确定因素也很多，有的研究人员认为可能是dsRNA释放效果不佳或RNAi载体中的Intron匹配度低等原因导致的，目前关于此的报道并不是很多，其原因需要更多的科学研究去发现。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，利用现代生物技术构建柑橘木虱卵黄蛋白原基因的RNAi载体，并将其导入生物防治真菌基因组中，从而缩短生防真菌对柑橘木虱的浸染时间，提高生防真菌对柑橘木虱的毒力，方案具体如下：一种柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体，包括骨架载体和发夹结构，所述发夹结构为ihpRNA表达盒，所述ihpRNA表达盒的结构为PtrpC启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+TtrpC终止子结构，所述目的基因片段为柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列DcVg1a或DcVg1b；所述骨架载体为丝状真菌表达载体。所述丝状真菌表达载体是利用PdmⅠ或者XmnⅠ、和PstⅠ2种酶对pRCy1载体进行酶切，获得含有HygR、intron片段的线性载体，再利用重组位点将PtrpC启动子+EGFP片段连入pRCy1线性载体中得到的。上述的柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体的构建方法：采用一步克隆法将PtrpC启动子+EGFP基因片段连接到丝状真菌表达载体pRCy1中获得pRCy3，用一步克隆法将目的基因的正向片段转入pRCy3载体启动子和intron之间，然后用一步克隆法转入反向片段，即得。在上述技术方案中，所述PtrpC启动子+EGFP基因片段是以pRCy2a为模板，设计含有XmnⅠ和PstⅠ酶酶切位点的引物，进行PCR扩增得到；利用PdmⅠ或者XmnⅠ、和PstⅠ2种酶对pRCy1载体进行酶切获得线性载体，利用重组位点用一步克隆法将得到的PtrpC启动子+EGFP片段连入pRCy1线性载体中，构建成含有EGFP、intron结构的丝状真菌双元载体pRCy3；先将pRCy3载体进行XhoⅠ和SmiⅠ双酶切，然后将目的基因的正向片段连入双酶切后的pRCy3，然后将连接有正向片段的载体用XbaI和BamHI进行酶切后连入对应的反向目的片段。本专利技术的再一目的在于提供上述的RNAi载体在防治柑橘木虱中的应用、在制备防治柑橘木虱的产品中的应用、在制备转基因生防真菌中的应用；优选所述生防真菌为渐狭蜡蚧菌。本专利技术的再一目的在于提供一种转基因生防真菌：是采用前述任一的RNAi载体转化生防真菌得到。优选地，所述生防真菌为渐狭蜡蚧菌，所述转化是由农杆菌介导；进一步优选地，所述农杆菌为AGL1。本专利技术的再一目的在于提供上述的转基因渐狭蜡蚧菌的制备方法：采用上述任一的RNAi载体转化农杆菌，随后利用诱导培养法将农杆菌诱导培养后与生防真菌孢子悬浮液共培养，分离、检测验证，得到转基因成功的生防真菌菌株。本专利技术的再一目的在于提供上述的转基因生防真菌在防治柑橘木虱中的应用、在制备防治柑橘木虱的产品中的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种柑橘木虱防治制剂：包含上述任一的RNAi载体，或者上述任一的的转基因生防真菌。本专利技术的有益效果是：选用柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列DcVg1a或DcVg1b构建发夹结构，选用丝状真菌表达载体作为骨架载体，通过特定的限制性内切酶酶切骨架载体，成功构建了柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体，使得最终获得的RNAi载体具有特定的ihpRNA表达盒结构(PtrpC启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+TtrpC终止子结构)，利用该RNAi载体转化生防真菌渐狭蜡蚧菌，得到的转基因渐狭蜡蚧菌经实验证实可有效提高其对柑橘木虱毒力的毒力，缩短对木虱的浸染时间。附图说明图1是PtrpC启动子+EGFP替换pRCy1载体中的MAS的载体构架框架图。图2是卵黄蛋白原基因RNAi载体构建图。图3是柑橘木虱VG基因的保守序列分析。图4是AGL1::GFP菌株的菌液PCR验证结果，其中，泳道1、2、3分别为三个AGL1::GFP阳性菌株检测到的潮霉素抗性基因阳性条带。图5是AGL1::DcVg1a和AGL1::DcVg1b菌株的菌液PCR和酶切验证结果，其中，图A为菌液PCR结果，1-6泳道为AGL1::DcVg1a、7-12泳道为AGL1::DcVg1b；图B为酶切验证结果，泳道1、2为AGL1::DcVg1a菌株质粒提取后酶切下来的目的片段；泳道3、4为AGL1::DcVg1b菌株质粒提取后酶切下来的目的片段。图6是农杆菌介导的渐狭蜡蚧菌转化过程示意图。图7是转基因菌株的菌丝快速鉴定结果，其中，图A是EGFP检测引物结果，泳道1-3为渐狭蜡蚧菌La::DcVg1a阳性菌株所含EGFP基因条带；泳道4-5为渐狭蜡蚧菌La::DcVg1b阳性菌株所含EG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体，包括骨架载体和发夹结构，其特征在于：所述发夹结构为ihpRNA表达盒，所述ihpRNA表达盒的结构为PtrpC启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+TtrpC终止子结构，所述目的基因片段为柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列DcVg1a或DcVg1b；所述骨架载体为丝状真菌表达载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体，包括骨架载体和发夹结构，其特征在于：所述发夹结构为ihpRNA表达盒，所述ihpRNA表达盒的结构为PtrpC启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+TtrpC终止子结构，所述目的基因片段为柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列DcVg1a或DcVg1b；所述骨架载体为丝状真菌表达载体。


2.如权利要求1所述的柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体，其特征在于：所述丝状真菌表达载体是利用PdmⅠ或者XmnⅠ、和PstⅠ2种酶对pRCy1载体进行酶切，获得含有HygR、intron片段的线性载体，再利用重组位点将PtrpC启动子+EGFP片段连入pRCy1线性载体中得到的。


3.如权利要求2所述的柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体的构建方法，其特征在于：采用一步克隆法将PtrpC启动子+EGFP基因片段连接到丝状真菌表达载体pRCy1中获得pRCy3，用一步克隆法将目的基因的正向片段转入pRCy3载体启动子和intron之间，然后用一步克隆法转入反向片段，即得。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PtrpC启动子+EGFP基因片段是以pRCy2a为模板，设计含有XmnⅠ和PstⅠ酶酶切位点的引物，进行PCR扩增得到；
利用PdmⅠ或者XmnⅠ、和PstⅠ2种酶对pRCy1载体进行酶切获得线性载体，利用重组位点用一步克隆法将得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：冉春，杨娟生，于士将，丛林，刘浩强，李鸿筠，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50