新型隐球菌细胞核指示载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了新型隐球菌细胞核指示载体及其构建方法和应用，该载体将细胞核定位的基因CWF19和绿色荧光基因EGFP融合表达，可以通过绿色荧光指示细胞核的具体位置和数目变化。本发明专利技术所得的载体具有安全性高，表达持久、稳定，制备简单的优点，对新型隐球菌的生殖特别是有性生殖具有重要的指示意义。

【技术实现步骤摘要】
新型隐球菌细胞核指示载体及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及新型隐球菌细胞核指示载体，还涉及该指示载体的方法和应用。
技术介绍
新型隐球菌(Crytococcusneoformans)是一种广泛存在于大自然中的酵母型机会性致病真菌，主要感染免疫力低下的器官移植患者和免疫力丧失的艾滋病患者等，造成真菌肺炎及隐球菌性脑膜炎等不同程度的病害。Rajasingham等人2017年的调查数据表明，全世界每年感染隐球菌的人数高达278000，并导致18万的人数死亡，死亡率高达64.7％。目前临床三大类药物有两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑，但是患者接受治疗的预后极差，这也给临床治疗和居民生活带来了极大的困扰。新型隐球菌通常在营养丰富时，表现为酵母形态，具有α和a两种交配型，此时表现为出芽生殖，感染性较低。但是在野外常常是干燥而又营养匮乏的情况下，隐球菌就会通过有性生殖的方式共同抵御这种极端环境，产生抗逆较强的繁殖体——孢子。孢子体积小，可以被人体吸入肺部，达到一定量后产生定植，会为以后的健康埋下隐患。基于隐球菌的交配特性和传播途径，其有性生殖的进程和机制一直是各研究机构和研究人员的关注热点。目前研究基础表明，隐球菌在有性生殖过程中，两个细胞融合后形成锁状联合，细胞核融合后减数分裂产生四个细胞核后，菌丝顶端膨大对应产生4条孢子链。但是影响隐球菌细胞核融合及分裂的机制和相关基因并不完全清楚。为了更好地研究细胞各时期各结构内部细胞核的数目变化，借助DAPI染色的方法在操作上对细胞结构的损害较大，且操作上多有繁琐。于是构建一个特异性定位在细胞核的基因与荧光蛋白融合的表达载体，再转化回隐球菌中，便可以直接清楚地观测到的细胞、双核菌丝、担子头等细胞结构内细胞核的动态变化。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种新型隐球菌细胞核指示载体；本专利技术的目的之二在于提供新型隐球菌细胞核指示载体的构建方法；本专利技术的目的之三在于提供所述载体作为新型隐球菌有性生殖指示载体中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、新型隐球菌细胞核指示载体，所述指示载体含有细胞核定位基因CWF19和绿色荧光基因EGFP融合表达的表达框，所述细胞核定位基因CWF19的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术中，所述指示载体由SEQIDNO.5所示序列连入pCN19载体的BamHI与SpeI酶切位点处。2、所述新型隐球菌细胞核指示载体的构建方法，具体步骤如下：克隆或合成细胞核定位基因CWF19，然后连入含有EGFP基因的真菌表达载体的EGFP基因下游，构成含有细胞核定位基因CWF19和绿色荧光基因EGFP融合表达的表达框。本专利技术中，克隆或合成细胞核定位基因CWF19，然后连入pCN19载体的BamHI与SpeI酶切位点处。3、所述载体作为新型隐球菌有性生殖指示载体中的应用。本专利技术中，所述载体作为新型隐球菌指示细胞核位置和数目变化的指示载体中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的提供新型隐球菌细胞核指示载体，利用Cwf19本身的特性与EGFP基因融合表达，可以有效地满足有性生殖过程中对目标的持续性观察，且Cwf19是隐球菌本身的基因，表达效果稳定，不易脱靶，安全性高，成本低，极大地方便了日常研究。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为重组载体pTBL177的质粒图谱。图2为重组载体的验证(A：构建重组载体的PCR验证；B：构建重组载体的酶切验证，EcoRV酶切后产生5575bp和4213bp两条带；C：将重组载体转化入新型隐球菌中的亚细胞定位结果)。图3为新型隐球菌定位结果(A：1000×Cwf19指示细胞核的结果；B：荧光菌株与DAPI的共定位，再次验证其核定位的结果，Bar＝10μm)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。实施例1、目的基因CWF19的PCR引物的设计和扩增从NCBI网站中查找的新型隐球菌中CWF19的基因序列号CNAG_01362，再在FungiDB数据库中找到目的基因的CDS序列，其序列如SEQIDNO.5所示，根据所得序列设计引物，上游引物含有BamHI酶切位点，下游引物含有SpeI酶切位点。TL1106:5’-gacgagctgtacggatccatggggagagacagcaccaacacg-3’(SEQIDNO.1)；TL1107:5’-ctggcggccgttactagtttaaacgccgtttcccacggtcca-3’(SEQIDNO.2)；扩增得到的目的片段大小为3004bpPCR反应体系按照DreamTaq酶(DreamTaqGreenPCRMasterMix2×)反应要求配制。反应模板为提取的新型隐球菌格鲁比变种野生型菌株H99基因组，具体提取步骤如下：1)取2个无菌的2mL破碎管，管中事先加好600μL425-600nm的无菌玻璃珠，600μLTENTSBuffer；2)用灭菌后的牙签取适量新鲜生长的菌体于破碎管中，进行搅拌充分后，加入600μL酚氯仿异戊醇(25:24:1)，配平后进行机械破碎(速度6m/s，共6轮，时间40s/轮)；3)破碎后样品进行15000rpm离心20min；4)取180μL上清于新的1.5mL离心管中，加入1/10体积即20μL的3MNaAc，2倍体积即400μL的无水乙醇，充分混匀后放于-20℃，20min进行核酸的沉淀；5)15000rpm离心10min，弃上清，所得沉淀为基因组，加入200μL的75％乙醇进行清洗一次，12000rpm离心5min，弃废液；将离心管倒扣于干净的吸水纸上，吸去多余液体，正置使乙醇挥发；加入100μL事先预热至65℃的ddH2O进行溶解，所得为H99基因组；使用Nanodrop测量浓度后，稀释至200ng/μL，可用于PCR模板。PCR体外扩增：50μL为一个反应，内含25μL预混Taq酶、引物(10μM)各0.5μL、模板1μL、ddH2O23μL补齐至总体积，这里有个小细节，当大量制备目的基因时，除模板以外的试剂先按倍数混匀后分装，再添加模板。反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性3min，72℃终延伸7min。PCR产物的电泳与回收：将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，按照Marker指示将目的条带切胶回收，回收操作按照Omega胶回收试剂盒说明书即可。实施例2、载体骨架的酶切准备载体骨架以含有EGFP的pCN19为例(Price,M.S.,etal.,2008.TheCryptococcusneoformansRho-GDPdissociationin本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.新型隐球菌细胞核指示载体，其特征在于：所述指示载体含有细胞核定位基因CWF19和绿色荧光基因EGFP融合表达的表达框，所述细胞核定位基因CWF19的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。/n

【技术特征摘要】
1.新型隐球菌细胞核指示载体，其特征在于：所述指示载体含有细胞核定位基因CWF19和绿色荧光基因EGFP融合表达的表达框，所述细胞核定位基因CWF19的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


2.根据权利要求1所述新型隐球菌细胞核指示载体，其特征在于：所述指示载体由SEQIDNO.5所示序列连入pCN19载体的BamHI与SpeI酶切位点处。


3.权利要求1或2所述新型隐球菌细胞核指示载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：克隆或合成细胞核定位基因CWF19，然后连入含...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘同宝，姜苏婷，韩连涛，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50