基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法技术

本申请提供了一种结合基因合成和酿酒酵母内源同源重组系统的分子克隆方法，不受限于序列改变的类型(删除、突变或者插入)和复杂度，仅涉及简单的体外分子克隆操作，利用两端带有同源臂的合成序列与酵母同源重组实现原载体的无缝修改，可实现4‑150kbp穿梭质粒上多个不连续DNA区段的同步改造和多种版本的批量构建，操作简单，构建效率较高，构建成功率较高，使得本发明专利技术适用于多版本、高通量的无缝克隆操作。

【技术实现步骤摘要】
基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法
本申请属于分子克隆
，尤其涉及一种基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法。
技术介绍
随着技术的发展，人们对于DNA的操纵能力逐步提升，对不同大小的质粒进行高效分子克隆的需求也更加多元化。随着测序和DNA合成技术的发展，研究者们对于DNA的操纵能力大大增强。在基因组合成领域，研究者目前已经成功化学合成了病毒和原核生物的基因组，以及真核生物酿酒酵母的部分染色体。而2016年基因组编写计划(GP-Write)则发起针对超大、复杂基因组的拆解-重装-解析的研究，去探索传统方法难以研究的科学问题。在代谢工程领域，利用微生物实现具有重要生理活性和医疗保健作用的天然化合物的全合成已成为世界研究热点，需要进行复杂代谢途径的构建和组装。在这些领域中，研究者们经常需要操纵大量长于10kbp的序列，其中10-150kbp的穿梭质粒(酵母CEN-大肠杆菌)使用需求日渐增多。但由于序列长度的原因，这一类质粒的定点修改存在一定的难度，难以实现对其上多区段进行同步深度改造，更遑论多个改造版本的同时构建。分子克隆技术作为现代生物学的核心技术，被广泛应用于合成生物学、蛋白纯化、生物制药等各个领域，目前有以下方法运用于基因片段的改造，包括：(1)传统的限制性内切酶克隆方法，包括两种不同的方法，一种是利用限制性内切酶特异性地识别目的DNA和载体上的酶切位点并进行切割，再通过连接酶，将二者连在一起得到目的质粒，也称为重组载体，但该方法常常出现在需要操作的位置没有可用的酶切位点的情况；另外一种是人为引入新的酶切位点，采用该方法连接起来的两个片段之间会各增加一个酶切位点的6-8bp的碱基片段，这种疤痕序列可能会对目标DNA片段产生影响，无法实现无缝拼接。(2)GoldenGate方法被建立，利用IIs型限制性内切酶的切割位点与识别序列分离的特征，通过合理的设计，可使多片段拼接的目的序列中不含有相应的酶切位点，实现多片段的无缝拼接。Gibson组装方法被建立，该方法同样适用于多个线性DNA片段的无缝拼接，通过为各顺序相邻的DNA片段添加20-80bp左右的短重叠序列，同时运用外切酶、聚合酶和DNA连接酶实现多DNA片段的一步组装。但在片段数目增多和片段长度增加时，以上两种方式的正确拼接效率会大幅度降低。若片段内部存在多个所使用的IIs型酶切位点，GoldenGate方法则更不适用。此外，若使用以上两种方式对10-150kbp的穿梭质粒进行多处序列改造时，需要通过引物扩增出修改后的片段，并引入酶切位点或者同源臂。序列扩增易受序列长度、GC含量以及序列重复度的影响，且对于较长的DNA片段，如大于10kbp，容易在序列内部产生非预期的突变。(3)CRISPR/Cas9系统与Gibson组装的联合方法被建立，利用CRISPR/Cas9系统在体外对22kbp的质粒进行切割，然后通过PCR扩增插入片段，添加同源序列，通过Gibson组装实现了在22kbp质粒载体上任意位点插入783bpDNA片段。(4)基于CRISPR/Cas9和酿酒酵母细胞内源的同源重组的分子克隆方法被建立，该方法通过设计特异的靶向gRNA，利用CRISPR/Cas9体系对初始载体在体外实现一处或多处的切割，回收后与缺口处带有同源序列的被替换DNA序列一同转化酵母实现质粒的构建，通过一次转化筛选操作，同时完成将一个或多个目的DNA片段的插入或删除。以上方法可进行分子克隆，但存在以下几个主要限制因素：一，需设计和构建特异性靶向待修改位点的gRNA表达载体，修改位点越多，需要的gRNA载体数目也越多；二，需购买或自备相应试剂进行sgRNA的体外转录和Cas9的体外切割；三，克隆成功率受限于gRNA的特异性以及体外切割体系的效率；四，若需对质粒进行多处修改时，每个版本均需定向制备多个带同源臂序列片段，相对繁琐，难以同时生成多版本的组合突变。目前，针对10-150kbp的穿梭质粒(酵母-大肠杆菌)，本领域内仍缺少通用型、可高效实现对中型质粒上多个不连续DNA区段同步无缝改造、多种深度改造版本同时构建的分子克隆策略。
技术实现思路
本申请的目的在于提供一种基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，旨在解决现有技术中对于较大穿梭质粒缺乏通用且高效的对单个或多个不连续DNA区段同步无缝改造的分子克隆策略的问题。为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：第一方面，本申请提供一种基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，所述分子克隆方法包括如下步骤：提供待修改载体，将所述待修改载体进行序列比对，确定所述待修改载体的修改区域及替换所述修改区域的标记基因；设计所述标记基因的第一同源臂引物序列并扩增得到所述标记基因，将所述标记基因片段与所述待修改载体共转化至野生型酿酒酵母细胞，筛选得到含有第一质粒前体的酿酒酵母细胞，其中，所述第一质粒前体包括所述标记基因；合成带有同源臂的供体序列并进行线性化处理得到线性化的供体序列，将所述线性化的供体序列转化至所述含有第一质粒前体的酿酒酵母细胞，筛选得到含有供体序列质粒的目的酿酒酵母细胞。第二方面，本申请提供一种基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，所述分子克隆方法包括如下步骤：提供待修改载体，将所述待修改载体进行序列比对，确定所述待修改载体的修改区域及替换所述修改区域的标记基因；设计所述标记基因的第二同源臂引物序列并扩增得到所述标记基因片段，将所述标记基因片段与所述待修改载体共转化至野生型酿酒酵母细胞，筛选得到含有第二质粒前体的酿酒酵母细胞，提取所述第二质粒前体并进行富集处理，其中，所述第二质粒前体包括所述标记基因和第二限制性内切酶识别位点；合成带有同源臂的供体序列，将所述供体序列和所述第二质粒前体分别进行线性化处理得到线性化供体序列和线性化第二质粒前体；将所述线性化供体序列和所述线性化第二质粒前体共转化至野生型酿酒酵母细胞中，筛选得到含有供体序列质粒的目的酿酒酵母细胞。本申请第一方面提供的分子克隆方法利用合成基因和酿酒酵母同源重组机制，通过对待修改载体的修改区域进行定位，并设计一对带有同源臂的引物用于标记基因的扩增，再利用酿酒酵母内源的同源重组机制，将标记基因片段对任意待修改的区域进行高效定向取代，获得含有质粒前体的酿酒酵母细胞，实现DNA修改的定位，进一步利用基因合成技术生成带同源臂的供体序列，直接将合成片段转化至含质粒前体的酿酒酵母细胞中，利用线性化的合成片段和酵母的同源重组机制实现相应区域的无缝修复，得到含有供体序列质粒的目的酿酒酵母细胞，该分子克隆方法可将多处修改位点合并为一个修改区域，实现在待修改载体的任意位置进行标记基因的插入替代，快速高效获得质粒前体；并结合基因合成技术提供供体序列，利用两端带有同源臂的合成序列与酵母同源重组实现供体序列对标记基因的无缝替代，实现原载体的任意类型(删除、突变或者插入)的修改，不需额外构建其他靶向载体；简单高效可以实现穿梭质粒上多个不连续DNA区段的同步改造和多种版本的批量构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，其特征在于，所述分子克隆方法包括如下步骤：/n提供待修改载体，将所述待修改载体进行序列比对，确定所述待修改载体的修改区域及替换所述修改区域的标记基因；/n设计所述标记基因的第一同源臂引物序列并扩增得到所述标记基因片段，将所述标记基因片段与所述待修改载体共转化至野生型酿酒酵母细胞，筛选得到含有第一质粒前体的酿酒酵母细胞，其中，所述第一质粒前体包括所述标记基因；/n合成带有同源臂的供体序列并进行线性化处理得到线性化的供体序列，将所述线性化的供体序列转化至所述含有第一质粒前体的酿酒酵母细胞，筛选得到含有供体序列质粒的目的酿酒酵母细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，其特征在于，所述分子克隆方法包括如下步骤：
提供待修改载体，将所述待修改载体进行序列比对，确定所述待修改载体的修改区域及替换所述修改区域的标记基因；
设计所述标记基因的第一同源臂引物序列并扩增得到所述标记基因片段，将所述标记基因片段与所述待修改载体共转化至野生型酿酒酵母细胞，筛选得到含有第一质粒前体的酿酒酵母细胞，其中，所述第一质粒前体包括所述标记基因；
合成带有同源臂的供体序列并进行线性化处理得到线性化的供体序列，将所述线性化的供体序列转化至所述含有第一质粒前体的酿酒酵母细胞，筛选得到含有供体序列质粒的目的酿酒酵母细胞。


2.根据权利要求1所述的基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，其特征在于，所述第一同源臂引物序列从5’-3’端依次包括所述修改区域的两侧同源臂序列以及所述标记基因的扩增引物序列。


3.根据权利要求2所述的基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，其特征在于，所述同源臂序列的长度为45～50nt。


4.根据权利要求1所述的基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，其特征在于，所述待修改载体选自大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体；且所述待修改载体的碱基数为4～150kbp。


5.一种基于合成基因和酿酒酵母同源重组机制的分子克隆方法，其特征在于，所述分子克隆方法包括如下步骤：
提供待修改载体，将所述待修改载体进行序列比对，确定所述待修改载体的修改区域及替换所述修改区域的标记基因；
设计所述标记基因的第二同源臂引物序列并扩增得到所述标记基因片段，将所述标记基因片段与所述待修改载体共转化至野生型酿酒酵母细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴俊彪，姜双英，唐园玮，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44