提高豆科植物除草剂抗性的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，公开了突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途。该方法能够有效解决现有技术中对豆科植物难以采用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术进行抗除草剂育种的问题。通过该方法制备获得的豆科植物植株具有明显抗除草剂的特性，将其应用于豆科植物尤其是大豆的育种和种植中可以很好地解决杂草防治中除草剂对作物生长具有负面影响的问题，有效避免了除草剂使用不当对作物生产的不利影响。

【技术实现步骤摘要】
提高豆科植物除草剂抗性的方法及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及豆科植物除草剂抗性的方法及其应用。
技术介绍
杂草在农作物生长过程中，不仅与作物争夺光照、生长空间与营养物质等，还会传播病虫害，释放有毒物质造成粮食减产。因此，为了避免杂草对粮食生产的危害，在农作物种植过程中往往会进行杂草防治。目前最常用的防治方法是喷施除草剂，该方法不仅省时省力，而且效果明显。但是，除草剂喷施过程中不可避免的会与农作物进行接触，在防治杂草的同时对农作物也造成了一定伤害，对于某些除草剂敏感的农作物而言，除草剂使用不当极容易导致作物死亡，对粮食产量提升和农民增收造成阻碍。因此，为了确保粮食产量和农民收入，亟需开发新型抗除草剂大豆品种。植物基因组编辑技术为植物基础科学和育种领域的革命提供了巨大的希望，为定向开发植物品种提供了可能。其中，CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术可以在不产生双链断裂的情况下实现靶向核苷酸替换(C到T或G到A)，这可以大大提高基因的碱基特异性替换效率。近来，利用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术研究人员成功地在西瓜、小麦和油菜的AHAS基因上引入了单碱基突变，获得了相应的抗除草剂品种。豆科植物中有大量极具经济价值的作物，其中，大豆是人类食物中植物蛋白的主要来源，也是植物油脂的主要来源之一。然而，豆科植物基因组复杂，例如大豆是古四倍体，其基因有约75％是以同源基因的形式表现的。由于大豆基因组结构复杂，同源基因较多，难以设计突变位点，而且对大豆进行基因编辑容易脱靶，造成筛选困难等问题，并且大豆的遗传转化还存在着流程复杂、周期长、效率低和成功率低的缺陷，极大限制了大豆基因组研究的发展，也使得基因编辑技术在大豆育种中应用受到了极大阻碍。到目前为止，尚未有利用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术对豆科植物基因进行定点编辑，获得抗除草剂的豆科植物的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途，通过该方法制备获得的豆科植物能够具有抗除草剂的特性，将其应用于豆科植物育种和种植中可以很好地解决种植过程中的杂草防治问题，有效避免了除草剂使用不当对豆科植物生产的不利影响。为了实现上述目的，本专利技术一方面提供突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途。本专利技术第二方面提供一种提高豆科植物除草剂抗性的方法，所述方法包括突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性。本专利技术第三方面一种提高豆科植物除草剂抗性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)通过生物大分子定量构效关系建立对应的生物大分子定量构效关系模型，对豆科植物中除草剂靶标蛋白抗性突变体进行抗性突变预测，初步筛选对除草剂具有较高抗性的除草剂靶标蛋白单点突变体和/或多点突变体；(2)通过定点突变技术，构建步骤(1)中初步筛选的突变体，并对其进行体外筛选，获得具有除草剂抗性的突变体；(3)根据步骤(2)的结果，利用单碱基编辑技术对豆科植物除草剂靶标蛋白进行定点修饰，将步骤(2)中体外筛选获得的具有除草剂抗性的突变体引入豆科植物植株，并对其进行培育和传代，获得纯合子代。本专利技术第四方面提供上述方法在豆科植物育种中的应用。通过上述技术方案，本专利技术采用生物大分子定量构效关系(MB-QSAR)对大豆中除草剂靶标蛋白抗性突变进行预测，建立对应的MB-QSAR模型，利用计算机技术进行靶标蛋白抗性突变体筛选，节约了大量实验的时间和材料，再对初步筛选的突变体进行体外筛选，最后利用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术将体外筛选获得的抗性突变引入豆科植物植株。实现了短时间、高通量、高效率的靶标蛋白抗性突变体筛选和转化。并通过该方法首次获得了不含转基因成分的抗除草剂大豆植株(例如GmAHAS4基因发生P180S纯合突变的抗除草剂大豆植株)，该方法的推广和应用可以很好的解决豆科植物，尤其是大豆种植过程中的杂草防治问题，为培育抗除草剂大豆新品种提供理论和实验基础，在既能够采用喷施除草剂的简单经济的防治方法的同时，将除草剂对大豆生产的影响降到最低。附图说明图1是T0代基因编辑材料的测序结果图；图2是野生型和纯合突变材料的测序结果对比图；图3是野生型和纯合突变材料的除草剂抗性对比图。具体实施方式以下将对本申请的具体实施方式进行详细阐述，应当能够理解的是，以下具体实施方式仅用于解释和说明本专利技术的内容，而不用于限制本专利技术。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。术语解释：生物大分子定量构效关系(MB-QSAR)：小分子3D-QSAR是上世纪八十年代末期出现的小分子性质预测和结构优化方法。该方法利用小分子周围三维空间中的分子场数值与小分子性质进行定量相关，从而实现对小分子性质的预测和提供化学直观的三维构效关系。按照该方法的基本原理，如果认为一系列具有类似结构作用域的蛋白大分子结合空腔中的分子场与蛋白大分子性质也存在定量关系，那么3D-QSAR同样可以用来实现对一系列蛋白大分子的定量构效关系研究。基于此，本专利技术的专利技术人发展了蛋白大分子MB-QSAR(Mutation-dependentBiomacromolecularQuantitativeStructureActivityRelationship，即本专利技术中所述生物大分子定量构效关系)方法用于蛋白大分子分析研究。生物大分子定量构效关系模型：在小分子的3D-QSAR研究中，当小分子具有不同的取代基时，会造成小分子周围空间分子场的变化从而影响小分子活性。而对于蛋白大分子，氨基酸残基的突变会影响蛋白局部结构的变化，同样造成局部三维空间中分子场的改变，而影响蛋白大分子与小分子相互作用的敏感程度。因此对小分子3D-QSAR方法进行改造，发展适用于生物大分子的3D-QSAR方法，利用生物大分子的3D-QSAR方法研究一系列蛋白大分子类似结构周围三维空间中的分子场分布，并将分子场与蛋白大分子与小分子相互作用的性质进行统计相关，得到能定量描述蛋白大分子的QSAR模型，此即为MB-QSAR(Mutation-dependentBiomacromolecularQuantitativeStructureActivityRelationship)的基本思路。乙酰羟酸合成酶：乙酰羟酸合成酶是微生物体和植物体中支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)合成途径中的关键性酶，其催化两分子的丙酮酸缩合生成2-乙酰乳酸，或催化一分子的丙酮酸与另一分子的2-酮丁酸形成2-乙酰-2-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途。/n

【技术特征摘要】
1.突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途。


2.一种提高豆科植物除草剂抗性的方法，其特征在于，所述方法包括突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性。


3.根据权利要求1所述的用途或权利要求2所述的方法，其中，所述除草剂靶标蛋白选自乙酰羟酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、原卟啉原氧化酶、八氢番茄红素脱氢酶、对羟苯基丙酮酸双氧化酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、谷氨酰胺合成酶和二氢蝶酸合成酶中的至少一种；
和/或，所述豆科植物选自大豆、花生、蚕豆、豌豆、赤豆、绿豆、豇豆、四季豆和扁豆中的至少一种；
优选地，所述豆科植物为大豆；
更优选地，所述除草剂靶标蛋白中的氨基酸位点选自乙酰羟酸合成酶1的103位丙氨酸、178位脯氨酸、186位丙氨酸、357位天冬氨酸、358位精氨酸、555位色氨酸、634位丝氨酸，乙酰羟酸合成酶2的107位丙氨酸、182位脯氨酸、190位丙氨酸、361位天冬氨酸、362位精氨酸、560位色氨酸、639位丝氨酸，乙酰羟酸合成酶3的97位丙氨酸、172位脯氨酸、180位丙氨酸、351位天冬氨酸、352位精氨酸、549位色氨酸、628位丝氨酸，乙酰羟酸合成酶4的105位丙氨酸、180位脯氨酸、188位丙氨酸、359位天冬氨酸、360位精氨酸、557位色氨酸、636位丝氨酸中的至少一种；
更优选地，所述突变选自将脯氨酸突变为丝氨酸/亮氨酸/苏氨酸/丙氨酸/组氨酸/谷氨酰胺/精氨酸/谷氨酸/异亮氨酸/酪氨酸、将丙氨酸突变为苏氨酸/缬氨酸/酪氨酸/苯丙氨酸、将天冬氨酸突变为谷氨酸、将色氨酸突变为亮氨酸/甘氨酸/蛋氨酸、将丝氨酸突变为天冬氨酰/苏氨酸/异亮氨酸中的至少一种。


4.一种提高豆科植物除草剂抗性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)通过生物大分子定量构效关系建立对应的生物大分子定量构效关系模型，对豆科植物中除草剂靶标蛋白抗性突变体进行抗性突变预测，初步筛选对除草剂具有较高抗性的除草剂靶标蛋白单点突变体和/或多点突变体；
(2)通过定点突变技术，构建步骤(1)中初步筛选的突变体，并对其进行体外筛选，获得具有除草剂抗性的突变体；
(3)根据步骤(2)的结果，利用单碱基编辑技术对豆科植物除草剂靶标蛋白进行定点...

【专利技术属性】
技术研发人员：席真，王宁宁，韦韬，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12