一种植物细胞外囊泡的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种植物细胞外囊泡的制备方法，具体包括以下步骤：先用PBS溶液对植物颗粒进行溶胀处理，再对材料进行渗漉，最后对所得渗漉液依次进行差速离心、超滤浓缩以及超高速冷冻离心即得；本发明专利技术方法不仅操作简单，植物利用率高，而且获取的植物来源细胞外囊泡浓度高且杂质很少，尤其适用于制备一些贵重中药材来源的细胞外囊泡。材来源的细胞外囊泡。材来源的细胞外囊泡。

【技术实现步骤摘要】
一种植物细胞外囊泡的制备方法


[0001]本专利技术属于细胞外囊泡
，具体涉及一种植物细胞外囊泡的制备方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指由细胞分泌产生的具有脂质双分子层结构的纳米囊泡，曾一度被认为是运输细胞排泄物的“垃圾袋”。经大量研究发现，细胞外囊泡内部携带着核酸、脂质、蛋白质等物质，能够将供体细胞的生物活性分子运送到达受体细胞。作为细胞间信息交流的纽带，细胞外囊泡参与免疫调控、伤口愈合、肿瘤生长等生理病理过程，可以广泛应用在疾病早期诊断、药物治疗、递送载体等生物医学领域。
[0003]近年来，由于植物来源的囊泡样纳米颗粒(Plant
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derived vesicle
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like nanoparticles，PDVLNs)资源丰富且安全无毒，而受到越来越多的关注。目前，植物细胞外囊泡常见的制备方法包括超速离心法、聚合物沉淀法、尺寸排阻法等，且在其前处理过程中通常是采用榨汁获取汁液或者是真空渗透获取质外体汁液的方式收集含有细胞外囊泡的样液进行分离纯化。然而上述制备过程中容易出现很多难以去除的细小杂质或者是容易出现提取效率不高的情况。而且榨汁或研磨等方式会使细胞破碎，在破碎过程中产生的双层膜结构不能称之为外囊泡但却会保留在最终产物中，所以对于通过榨汁或研磨等方式得到的植物细胞外囊泡产品而言，提取出的只能称作植物类外泌体囊泡。
[0004]因此，如何实现高效率制备植物来源细胞外囊泡成为了一个待解决的难题，尤其是遇到一些名贵中药材时，更应当开发一种能够充分利用其有效成分的细胞外囊泡制取方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在提供一种植物细胞外囊泡的制备方法，该方法获得的植物来源细胞外囊泡浓度高且杂质很少，在基础机制研究、药物开发、递送载体等生物医学领域具有良好的应用价值。
[0006]本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]一种植物细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0008]S1、用PBS溶液对植物颗粒进行溶胀处理；
[0009]S2、对步骤S1所得材料进行渗漉，且渗漉所用溶剂为含有复合酶的PBS溶液，其中所述复合酶用以裂解植物细胞壁但不破坏细胞膜；
[0010]S3、对步骤S2所得渗漉液进行离心，以收集得到细胞外囊泡。
[0011]优选地，在上述制备方法中，PBS溶液含有5
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10mM Na2HPO4、130
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140mM NaCl、1
‑
5mM NaH2PO4。
[0012]优选地，在上述制备方法中，所述复合酶由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶组成。
[0013]更为优选地，在渗漉溶剂中，纤维素酶的浓度为1
‑
10U/mL，半纤维素酶的浓度为1
‑
10U/mL，果胶酶的浓度为2
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20U/mL，木瓜蛋白酶的浓度为2
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20U/mL。
[0014]优选地，在上述制备方法中，步骤S3具体为：先对步骤S2所得渗漉液进行差速离心，再超滤浓缩并用微孔滤膜过滤，最后经超高速冷冻离心收集得到细胞外囊泡。
[0015]更为优选地，差速离心的操作具体为：先于800
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1200g离心10
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30min，再于2500
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3500g离心30
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60min，最后于10000
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15000g离心60
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120min。
[0016]更为优选地，超滤浓缩的条件为：在分子截留量为5
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150kDa的超滤浓缩管中经2500
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3500g离心15
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45min。
[0017]更为优选地，超高速冷冻离心的条件为：≤4℃，100000
‑
150000g离心60
‑
120min。
[0018]优选地，在上述制备方法中，步骤S1中PBS溶液用量为植物颗粒质量的0.5
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2倍。
[0019]在本专利技术的制备方法中，植物为新鲜的单种材料，或为干燥的单种材料，或为新鲜的复方材料，或为干燥的复方材料；且上述材料可以为饮片、粉末等。
[0020]在本专利技术的制备方法中，植物包括但不限于人参、天麻、当归、灵芝、藏红花、天山雪莲等。
[0021]本专利技术提供的制备方法的原理为：本专利技术先将植物材料破碎成微小颗粒，加入适量PBS溶液使植物材料吸水溶胀并恢复原有细胞结构；再使用PBS溶液为渗漉溶剂，并在渗漉溶剂中加入复合酶，以便于原生质体中的细胞外囊泡的充分析出；渗漉过程收集不断扩散溶出的细胞外囊泡，从而实现名贵中药材的充分利用；对收集渗漉液进行多次离心除去酶解过程中产生的大颗粒杂质，再经过超滤浓缩管除去样液中的小分子杂质，最后采用超高速冷冻离心将植物样液中的细胞外囊泡富集沉淀下来。
[0022]需要注意的是，根据本专利技术提供的制备方法获得的植物细胞外囊泡也应属于本专利技术的保护范围。
[0023]相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0024](1)本专利技术以特定组成的PBS溶液作为平衡盐溶液，先利用该PBS溶液对植物材料进行溶胀，再以含有复合酶的PBS溶液作为渗漉溶剂；在渗漉过程中，PBS溶液通过平衡渗透压的方式使细胞外囊泡进入溶剂中，复合酶能够迅速且选择性的裂解细胞壁，以充分释放原生质体中的细胞外囊泡，提高了细胞外囊泡通过平衡渗透压进入溶剂的效率。
[0025](2)本专利技术采用渗漉法收集细胞外囊泡，相对于其他浸出方式，渗漉属于动态浸出方法，溶剂利用率高，且更有利于细胞外囊泡的溶出；同时随着溶剂不断的流动，少了细胞壁束缚的细胞会进一步促进多泡体向外分泌产生新的细胞外囊泡。可见，本专利技术利用渗漉和复合酶的协同作用，大大提高了细胞外囊泡的提取效率。
[0026](3)本专利技术在对渗漉液的纯化富集过程中，需要严格控制离心力以及离心时间，以达到除去酶解细胞壁过程中产生的杂质以及其他溶出杂质的目的，同时还需避免损伤细胞外囊泡的结构，以保证完整的细胞外囊泡结构和较高的纯度。
[0027](4)本专利技术公开的制备方法不仅操作简单，提取效率以及植物材料利用率也高，适用于制备植物材料来源的细胞外囊泡，尤其适用于珍贵的中药材，如人参、灵芝、藏红花、天山雪莲等。
附图说明
[0028]图1为本专利技术实施例采用的植物细胞外囊泡渗漉处理的装置示意图。
[0029]图2为实施例1制备获得的人参细胞外囊泡粒径分布图(A)和透射电镜图(B)；
[0030]图3为实施例2制备获得的天麻细胞外囊泡粒径分布图(A)和透射电镜图(B)；
[0031]图4为实施例3制备获得的当归细胞外囊泡粒径分布图(A)和透射电镜图(B)；
[0032]图5为对比例1制备获得的当归本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、用PBS溶液对植物颗粒进行溶胀处理；S2、对步骤S1所得材料进行渗漉，且渗漉所用溶剂为含有复合酶的PBS溶液，其中所述复合酶用以裂解植物细胞壁；S3、对步骤S2所得渗漉液进行离心，以收集得到细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述植物细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述PBS溶液含有5
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10mM Na2HPO4、130
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140mM NaCl、1
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5mM NaH2PO4。3.根据权利要求1或2所述植物细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述复合酶由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶组成。4.根据权利要求3所述植物细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，在所述溶剂中，所述纤维素酶的浓度为1
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10U/mL，所述半纤维素酶的浓度为1
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10U/mL，所述果胶酶的浓度为2
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20U/mL，所述木瓜蛋白酶的浓度为2
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20U/mL。5.根据权利要求1所述植物细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，步骤S3具体为：先对步骤S2所得渗漉液进行差速离心，再超滤浓缩并用微孔滤膜过滤，最后经超高速冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：华权高，詹雷雷，赖余芬，
申请(专利权)人：武汉金开瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：