一种黄瓜核糖体的提取方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种核糖体的提取方法，属于核糖体提取技术领域。在本发明专利技术中，将黄瓜块与PBS溶液混合打浆，经第一离心、第二离心、第三离心、超速离心和第四离心，制备得到了80S黄瓜核糖体。提取得到的80S黄瓜核糖体比较完整、得率高，从500g的黄瓜中可以提取备约2400OD26080S的核糖体，解决了核糖体提取困难、收率低的问题，为蛋白结构解析和功能分析奠定了基础。奠定了基础。奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种黄瓜核糖体的提取方法及其应用


[0001]本专利技术涉及核糖体提取
，尤其涉及一种黄瓜核糖体的提取方法及其应用。

技术介绍

[0002]核糖体是细胞内一种主要由RNA和蛋白质构成的核糖核蛋白颗粒。核糖体在mRNA的翻译、蛋白质折叠、肽基转移和肽基水解等过程中发挥重要作用。通过对核糖体的结构解析以及作用机制的分析能够有助于阐明蛋白质的合成与修饰机制，因此了解核糖体的工作机制对了解生命具有重要意义。ThomasA.Steitz教授也因为在核糖体结构和功能分析领域中作出的贡献而获得诺贝尔化学奖。高纯度、具有生物活性的蛋白样品的制备是蛋白结构解析以及功能分析的基础和前提。
[0003]目前使用较广泛的提取多聚核糖体的方法主要分为蔗糖密度梯度离心法和免疫沉淀法。蔗糖密度梯度离心法主要在对细胞进行破碎、过滤之后，将匀浆液加入蔗糖密度梯度溶液中，并使用超速离心仪进行离心分离。该方法虽然收率较高，但对设备要求高，操作复杂。有文献报道使用垂直转头密度梯度超速离心法，快速分级分离多聚核糖体，但对仪器设备要求同样较高。现有的免疫沉淀法在植物中的拟南芥中有应用，但该方法核糖体的收率较低，不适合做后续的深入研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种黄瓜核糖体的提取方法，该方法操作简便，能高效地提取大量黄瓜核糖体。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种黄瓜核糖体的提取方法，包括以下步骤：
[0007]S1.将黄瓜块与PBS溶液混合、榨汁，得混合物；所述黄瓜块与PBS溶液的重量比为4～7:25；
[0008]S2.将步骤S1所述混合物进行第一离心，取上清液1；所述第一离心的离心力为2000～3000g，所述第一离心的时间为20～30min；
[0009]S3.将步骤S2所述上清液1进行第二离心，取上清液2；所述第二离心的离心力为5000～6000g，所述第二离心的时间为60～90min；
[0010]S4.将步骤S3所述上清液2进行第三离心，取上清液3；所述第三离心的离心力为9000～10000g，离心时间为60～90min；
[0011]S5.将步骤S4所述上清液3用滤膜过滤，取滤液；
[0012]S6.将步骤S5所述滤液进行超速离心，弃上清，得沉淀物；所述超速离心的转速为100000～140000g，所述超速离心的时间为60～90min；
[0013]S7.将步骤S6所述沉淀物与PBS溶液混合，重悬后进行第四离心，取上清，得黄瓜核糖体悬液；所述第四次离心的离心力为14000～16000g，所述第四次离心的时间为15～
30min。
[0014]优选的，步骤S1和S7所述PBS溶液的浓度分别为0.01～0.02M。
[0015]优选的，所述第一离心、第二离心、第三离心、超速离心、第四离心的温度分别为3～5℃。
[0016]优选的，所述榨汁的时间为1～5min。
[0017]优选的，步骤S7所述PBS溶液与S6所述沉淀物的比例为1～5μL:1μg。
[0018]优选的，步骤S5所述滤膜的孔径为0.21～0.23μm。
[0019]本专利技术还提供了所述提取方法得到的黄瓜核糖体。
[0020]本专利技术还提供了所述的黄瓜核糖体在蛋白结构解析和功能分析中的应用。
[0021]通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
[0022]本专利技术通过结合差速离心与超速离心的方法简便、高效地制备大量黄瓜核糖体，所制备的黄瓜核糖体可用于蛋白结构解析和功能分析。
附图说明
[0023]图1为黄瓜核糖体的冷冻电镜图像。
[0024]图2为黄瓜核糖体的冷冻电镜密度图。
[0025]图3为黄瓜核糖体的冷冻电镜密度图局部分辨率(不同颜色代表分辨率不同)。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种黄瓜核糖体的提取方法，包括以下步骤：
[0027]S1.将黄瓜块与PBS溶液混合、榨汁，得混合物；所述黄瓜块与PBS溶液的重量比为4～7:25；
[0028]S2.将步骤S1所述混合物进行第一离心，取上清液1；所述第一离心的离心力为2000～3000g，所述第一离心的时间为20～30min；
[0029]S3.将步骤S2所述上清液1进行第二离心，取上清液2；所述第二离心的离心力为5000～6000g，所述第二离心的时间为60～90min；
[0030]S4.将步骤S3所述上清液2进行第三离心，取上清液3；所述第三离心的离心力为9000～10000g，离心时间为60～90min；
[0031]S5.将步骤S4所述上清液用滤膜过滤，取滤液；
[0032]S6.将步骤S5所述滤液进行超速离心，弃上清，得沉淀物；所述超速离心的转速为100000～140000g，所述超速离心的时间为60～90min；
[0033]S7.将步骤S6所述沉淀物与PBS溶液混合，重悬后进行第四离心，取上清，得黄瓜核糖体悬液；所述第四次离心的离心力为14000～16000g，所述第四次离心的时间为15～30min。
[0034]在本专利技术中，将黄瓜去皮，用水清洗干净，切块，得黄瓜块；所述水优选为DEPC处理的双蒸水。
[0035]本专利技术将黄瓜块与PBS混合，榨汁，得混合物；所述黄瓜块与PBS溶液的重量比优选为4～7:25，进一步优选为5～6:25；所述PBS溶液的浓度优选为0.01～0.02M，进一步优选为0.015M；所述榨汁的时间优选为2～5min，进一步优选为3～4min，更优选为3.5min；所述榨
汁优选在榨汁机中进行。本专利技术在榨汁后的操作温度优选为3～5℃，更优选为4℃。
[0036]本专利技术将步骤S1所述混合物进行第一离心，取上清液1；所述第一离心的离心力优选为2000g～3000g，进一步优选为2200～2800g，更优选为2500g；所述第一离心的时间优选为20～30min，进一步优选为23～28min，更优选为25min；所述第一离心的目的是去除体积较大的植物纤维。
[0037]本专利技术将所述上清液1进行第二离心，取上清液2；所述第二离心的离心力优选为5000～6000g，进一步优选为5300～5700g，更优选为5500g；所述第二离心的离心时间优选为60～90min，进一步优选为70～80min，更优选为75min；所述第二离心的目的是去除细胞碎片以及细胞核。
[0038]本专利技术将上清液2进行第三离心，取上清液3；所述第三离心的离心力优选为9000～10000g，进一步优选为9400～9800g，更优选为9600g；所述第三离心的时间优选为60～90min，进一步优选为65～82min，更优选为70min；所述第三离心的目的是去除线粒体。
[0039]在本专利技术中，将所述上清液3用滤膜过滤，取滤液；所述滤膜的孔径优选为0.21～0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄瓜核糖体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将黄瓜块与PBS溶液混合、榨汁，得混合物；所述黄瓜块与PBS溶液的重量比为4～7:25；S2.将步骤S1所述混合物进行第一离心，取上清液1；所述第一离心的离心力为2000～3000g，所述第一离心的时间为20～30min；S3.将步骤S2所述上清液1进行第二离心，取上清液2；所述第二离心的离心力为5000～6000g，所述第二离心的时间为60～90min；S4.将步骤S3所述上清液2进行第三离心，取上清液3；所述第三离心的离心力为9000～10000g，离心时间为60～90min；S5.将步骤S4所述上清液3用滤膜过滤，取滤液；S6.将步骤S5所述滤液进行超速离心，弃上清，得沉淀物；所述超速离心的离心力为100000～140000g，所述超速离心的时间为60～90min；S7.将步骤S6所述沉淀物与PBS溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：段莉，曾斌，张行，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：