本发明专利技术公开了一种含Fc融合蛋白的真核表达载体及其构建方法，步骤如下：制备Fc基因片段；将所得的Fc基因片段连接到pMD18-T载体中，得连接产物pMD18T-Fc；构建表达载体：将所得的连接产物pMD18T-Fc和表达载体pCDNA3.1经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc。本发明专利技术制得含Fc端融合蛋白的真核表达载体，可直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体中，快速、高效的表达含Fc端的融合蛋白。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，步骤如下：制备Fc基因片段；将所得的Fc基因片段连接到pMD18-T载体中，得连接产物pMD18T-Fc；构建表达载体：将所得的连接产物pMD18T-Fc和表达载体pCDNA3.1经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc。本专利技术制得含Fc端融合蛋白的真核表达载体，可直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体中，快速、高效的表达含Fc端的融合蛋白。【专利说明】含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法
本专利技术涉及一种真核表达载体及其构建方法，特别涉及一种含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法。
技术介绍
抗体的Fe端负责抗体的效应功能，如激活补体、结合Fe受体、穿越胎盘等。Fe融合蛋白主要是将生物活性蛋白与IgG的绞链区及CH2、CH3区结合。Fe融合蛋白具有如下特征:(I)通过与抗IgG或蛋白A结合用于检测或纯化；(2)通过该蛋白分子与其配体的相互作用将Fe段的生物学效应引到特定目标，如ADCC、固定补体及免疫调节作用等；(3)增加该蛋白在血液中的半裳期，利于重组蛋白作为治疗药物在临床中的实际应用；(4) IgG、IgM和IgA的Fe结构域可形成多聚合分子，使重组蛋白具有更强的抗原结合力。目前常用的表达载体中未含有Fe端融合蛋白的基因，在表达该类蛋白时需要自己构建，而现有技术方案是将生物活性蛋白的基因与Fe段基因通过重叠PCR连接好后，再构建到表达载体中，比较费时，费力。
技术实现思路
基于此，针对现有技术表达载体中未含有Fe端融合蛋白的基因,构建含有Fe的表达载体时，费时费力的问题，本专利技术提供含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法。解决上述技术问题 的具体技术方案如下:一种含Fe融合蛋白的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤:(I)制备Fe基因片段，所述Fe基因片段碱基组成如SEQ ID N0.3所示；(2)将步骤(1)所得的Fe基因片段连接到pMD18-T载体中，得连接产物pMD18T-Fc ；(3)构建表达载体:将步骤(2)所得的连接产物pMD18T_Fc和表达载体p⑶NA3.1经EcoR I , Not I双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fe融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1-Fc。在其中一些实施例中，步骤(1)所述的Fe基因片段的制备方法为:以人IgGl的重链恒定区为模板，用引物扩增，得Fe基因片段。在其中一些实施例中，所述的引物为:上游引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，下游引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。在其中一些实施例中，步骤(2)所述的连接为:于21_23°C连接0.9-1.lh。根据上述构建方法制得一种含Fe融合蛋白的真核表达载体。本专利技术一种含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法具有以下优点和有益效果:本专利技术的构建方法，可快速、高效的表达含Fe端的融合蛋白，利用该方法得到的含Fe端融合蛋白的真核表达载体，可直接将具生物活性的蛋白基因构建到该表达载体中，显著改善的非Ig蛋白药物动力学特性。【专利附图】【附图说明】图1为人IgG1Fc基因的PCR扩增结果示意图；图2为所制备的载体P⑶NA3.1-Fc构建示意图；图3为P⑶NA3.1-Fc琼脂糖凝胶电泳图。具体实施例本专利技术通过将1gG1的绞链区及CH2、CH3区即Fe段，构建到真核表达p⑶NA3.1中，获得一种含Fe融合蛋白的真核表达载体及其构建方法，该构建方法可快速、高效的表达含Fe端的融合蛋白。为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂或者试剂盒，均为市售产品。其中，质粒H:暨南大学邓宁教授惠赠PMD18T-PLCH ；所用培养基的配方如下:LB培养基:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCllg，溶于IOOmL去离子水中，高压蒸气灭菌。含Amp的LB琼脂平板培养基:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCllg, 1.5g琼脂条溶于IOOmL去离子水中，高压蒸气灭菌，灭菌完成后待温度降为50°C是加入Amp，使终浓度为 50 μ g/mL0含Zeocin的LB固体平板培养基:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g,NaCllg, 1.5g琼脂条溶于IOOmL去离子水中，高压蒸气灭菌，灭菌完成后待温度降为50°C是加入Zeocin，使终浓度为25 μ g/mL。以下将结合具体实施例进一步阐述本专利技术。实施例11.制备Fe基因片段:以人IgG1的重链恒定区为模板，用引物人扩增，得Fe基因片段；其中，所述的引物为:SEQ ID N0.1上游引物:GAATTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT，SEQ ID N0.2下游引物:GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC。(PCR扩增结果参见图1，其中M为DNA Marker; I为Fe基因片段)其中，Fe基因片段的碱基组成为:SEQ ID N0.3GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。具体扩增体系如下(所用dNTP Mixture、Taq均购自日本宝生物工程本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含Fc融合蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备Fc基因片段，所述Fc基因片段的碱基组成如SEQ ID NO.3所示；（2）将步骤（1）所得的Fc基因片段连接到pMD18‑T载体中，得连接产物pMD18T‑Fc；（3）构建表达载体：将步骤（2）所得的连接产物pMD18T‑Fc和表达载体pCDNA3.1经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，得含Fc融合蛋白的真核表达载体pCDNA3.1‑Fc。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：万晓春，吕卫东，于广，邓宁，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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