一种禽用融合型口服干扰素的制备及其应用制造技术

一种禽用融合型口服干扰素的制备及其应用，利用禽类干扰素α、γ基因保守序列为基础，将具有较强抗病毒作用的干扰素α基因和能够提高机体免疫力、增强机体体质的干扰素γ基因融合表达，表达的α+γ融合干扰素兼有二者协同功能。同时，利用盐藻生物反应器作为表达系统，该系统除能表外源基因外，盐藻自身的营养丰富、无毒无害等优点也得以利用，制备得到“一株多用”的基因藻株，应用该转基因藻株制备出的禽用融合型口服干扰素，可应用于禽类病毒性疾病的预防或治疗、禽类养殖业和相关饲料加工业等领域，效果好且绿色环保、成本低廉。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制药领域，具体地说是一种禽用融合型干扰素的制备其应用。
技术介绍
目前，对我国禽类养殖业危害最大、也最难控制的一类疾病是传染性的病毒性疾病。针对于禽类该类疾病，一直没有有效的治疗方法和手段，其中疫苗接种是当前防止禽类病毒性疾病暴发和流行的主要措施和关键环节。但随着疫苗预防失败或接种不及时，一些病毒性疾病在禽类养殖中的时常爆发，传染性和死亡率极高，有些可达100%。一旦爆发病毒性疾病时，干扰素等生物制剂是目前市场上治疗的首选药物。但当前市场应用的干扰素以单价型为主，并多属于注射型，其使用起来操作繁琐、成本高、费工费时，效果不太理想。并且，当前禽类干扰素的生产主要以原核表达系统为主，也有利用真核细胞表达系统。原核表达系统存在不能进行蛋白质的转录和翻译后修饰功能，且表达产物多是不溶性的胞内包涵 体，产量低，需要复杂的加工纯化等过程；真核细胞表达系统存在着成本昂贵、条件要求苛亥IJ、蛋白质产物易受到污染、且纯化困难和难以规模化等缺点，均限制了二者系统的应用。因此，寻找新的生物反应器生产多价复合型的干扰素成为目前干扰素的主要研发方向。盐藻{J)unediella salina)是生活在咸水中的一种单细胞真核藻类,其自身具有许多其它反应器无法比拟的优点，如1)盐藻本身营养丰富，富含￠-胡萝卜素、维生素和蛋白质等成份，具有极高的营养价值和医用价值；2)盐藻属于光能自养型生物，可直接采用开放式大规模培养，培养成本廉价，生产费用低；3)盐藻本身无毒无害，是一种天然的保健品，可以提高机体免疫力和抵抗力；4)盐藻是一种天然的原生质体，对其进行遗传转化操作简单；5)盐藻培养安全可靠，不会对环境造成污染。6)盐藻属于真核生物，具有转录和翻译后对蛋白的加工能力，能产生近天然的高活性蛋白。
技术实现思路
鉴于目前禽用干扰素的生产和应用现状，本专利技术提供一种禽用融合型口服干扰素的制备方法，所制备的融合型口服干扰素能够抗病毒治疗疾病，提高机体的免疫力、改善禽类机体肉质品质。该产品的研制成功对禽类病毒性疾病的预防和治疗都具有十分重要的现实意义，存在巨大的经济效益和商业价值。一种禽用融合型口服干扰素的制备及其应用，其具体步骤如下 步骤一、禽a、Y干扰素基因的制备对全球公共序列数据库GenBank已登录的鸡、鸭和鹅三种动物的a、Y干扰素基因分别进行序列比对，结合盐藻细胞基因组密码子的偏爱性，对三种动物二者基因的碱基序列进行改造修饰，人工合成了三种禽类通用的a干扰素序列(序列表序列I)、Y干扰素序列(序列表序列2)。依据基因序列，分别设计特异性引物，通过PCR的方法扩增禽a、y干扰素基因； 步骤二、转化盐藻细胞真核表达载体构建通过PCR扩增的禽a、y干扰素基因片段分别与PMD18-T克隆载体连接，通过各自的双酶切鉴定和测序鉴定后分别切下a、Y基因片段，通过T4连接酶先后将二者基因连接到真核表达载体pBI-上；将构建好的重组载体pBI-a + y用于对盐藻细胞的转化； 步骤三、重组表达载体转化盐藻细胞将构建好的重组质粒通过高效的玻璃珠转化法，或通过现有的基因枪法、电击法、脂质体介导法或超声波导入法转化盐藻细胞。转化后的盐藻细胞经选择培养基筛选培养，最终获得阳性转化株。挑取阳性藻落分别进行扩大培养，供后续分子生物学鉴定所用； 步骤四、对转化藻株的筛选与分子生物学鉴定提取转基因藻株的基因组总RNAjf-合到盐藻基因组中的目的基因进行RT-PCR扩增鉴定，以期查明目的基因整合与表达状态。同时，利用western blot技术对表达得蛋白产物进行生化活性分析； 步骤五、融合型口服干扰素的制备将鉴定正确的转基因藻株按1%的接种量接种于天然海水藻类养殖池，进行开放式的规模化养殖。培养约10-14天，当藻细胞浓度达到10 6个 /ml时，通过静止沉淀或离心收集藻体，即得到融合型口服干扰素，可根据不同的用途进行下一步步骤六或步骤七工艺； 步骤六、在预防或治疗禽类病毒性疾病中的应用为达到此用途，可采用以下技术方案低温条件下采用超声波粉碎，裂解的盐藻体按占鸡饮水体积的5%的比例加入，现配现用，控制在0. 5-2h内饮完； 步骤七、作为一种功能性饲料添加剂在禽类养殖业和饲料加工业中的应用为达到此用途，可采用以下技术方案将该转基因藻株直接或经过浓缩、低温干燥、制粒、粉碎或与其它营养成分混合等加工后，添加到禽类动物养殖饲料中。添加量为1_7%，添加形态可以为粉齐U、颗粒剂等固体形式、也可以是糊剂、丸剂等半固体形式，也可以是液体形式。有益效果 I、本专利技术所制备的干扰素为融合型的二价干扰素，是利用禽类保守性较强的干扰素a、Y基因序列为基础，a基因具有强的抗病毒作用，能够起到治疗病毒性疾病的目的；Y基因能够调节机体体质、增强机体免疫力的作用，将二者基因进行融合表达a+ Y，能够起到上述二者作用的协同效果，治疗作用更佳。2、本专利技术克服了当前干扰素生产系统存在的不足，利用了集多种优点为一身的盐藻细胞作为表达系统。将干扰素a + Y基因转化盐藻细胞制备得到转基因藻株。该转基因藻株不需要诱导、分离和提纯等复杂的加工过程，可直接作为活性干扰素制剂投喂家禽，操作过程简便，省时省力。同时，盐藻自身的优点也得以利用，能够起到“一株多用”的效果，即能够起到抗病毒、提高机体免疫力外,还能够加快机体的生长速度、改善肉质品质等优点，是一种营养丰富的绿色抗病毒制剂。3、本专利技术所制备的干扰素制剂能够采用天然开放式工厂化养殖，其不仅产量高、成本低廉，而且不易受外界微生物的污染，生物安全性好。4、本专利技术巧妙利用了盐藻、家禽、干扰素三者之间存在的密切联系干扰素具有较强的抗病毒作用，病毒能够感染家禽，家禽又能以盐藻作为饲料组分，而盐藻又是一个理想的绿色表达系统。为此，通过转基因手段制备的工程藻株无需提纯加工便可通过口服方式直接投喂，方便快捷，避免了注射等方式的不利影响。这种天然绿色的活性干扰素制剂直接通过口服给药方式进行，在国内外尚未见报道。5、本专利技术制备的干扰素制剂不仅能作为禽用抗病毒药物得以应用，而且又可作为一种多功能的饲料添加剂在禽类养殖业和饲料加工业中得以应用，且该添加剂具有无任何毒副残留、无抗药性、绿色环保等优点。附图说明图I为禽a基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测电泳 图中左侧为分子量2000 Marker，右侧为PCR产物样品 图2为禽Y基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测电泳 图中M为分子量2000 Marker ；B为空白对照；P为两个重复的PCR产物样品； 图3为pBI-a重组质粒的取BernH双酶切琼脂糖凝胶检测电泳 图中左侧为pBI-a重组质粒双酶切后DNA片段，右侧为Marker ； 图4为pBI-a + Y重组质粒的及 和fee双酶切琼脂糖凝胶检测电泳 图中左侧为pBI-a + Y重组质粒双酶切后DNA片段，右侧为Marker ； 图5为转化盐藻细胞的真核表达载体pBI-a +Y结构示意图 图6为转基因藻株的固体培养基筛选培养结果 图中左侧平皿为阴性对照组，即野生型盐藻细胞的生长情况，无单藻落出现；右侧平皿为转化藻株的生长情况，可见有多个单藻落的生长； 图7为对阳性转化株进行a基因的PCR扩增鉴定 图中M为分子量2000本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽用融合型口服干扰素的制备，其特征在于：其具体制备步骤如下：1）禽α、γ干扰素基因的制备：分别设计两对特异性引物：禽α干扰素基因引物序列为：上游引物：5’TCTAGAATGGCTGGGCCATCAGCCCC3’，下游引物：5’？GGATCCCGTGTTGGTGCGGGT？3’，下划线所指为上下游引物分别引入的Xba？？和BamH？？酶切位点；γ干扰素基因基因引物序列为：上游引物：5’GGATCCACTTGCACTACCCAGACTTAC3’，下游引物：5’？GAGCTCTTACGTGTTGGTGCGGGTGA？3’，下划线所指为上下游引物分别引入的BamH？和Sac？？酶切位点，然后通过PCR的方法分别扩增出禽α干扰素基因和禽γ干扰素基因；禽α干扰素基因序列如序列表序列1，禽γ干扰素基因序列如序列表序列2；2）转化盐藻细胞真核表达载体构建：通过PCR扩增的禽α、γ干扰素基因片段分别与pMD18？T克隆载体连接，通过各自的双酶切鉴定和测序鉴定后分别切下α、γ基因片段，通过T4连接酶先后将二者基因连接到真核表达载体pBI？上；将构建好的重组载体pBI？α+γ用于对盐藻细胞的转化；3）重组表达载体转化盐藻细胞：将构建好的重组质粒通过玻璃珠转化法，或通过基因枪法、电击法、脂质体介导法或超声波导入法转化盐藻细胞；转化后的盐藻细胞经固体选择培养基筛选培养，最终获得阳性转化藻株；挑取阳性藻株进行扩大培养，供后续分子生物学鉴定所用；4）对转化藻株的筛选与分子生物学鉴定：提取转基因藻株的基因组总RNA，对整合到盐藻基因组中的目的基因进行RT？PCR扩增鉴定，以期查明目的基因整合与表达状态，同时，利用western？blot技术对表达得蛋白产物进行生化活性分析；5）融合型口服干扰素的制备？将鉴定正确的转基因藻株按1%的接种量接种于天然海水藻类养殖池，进行开放式的规模化养殖，培养10？14天，当藻细胞浓度达到106个/ml时，通过静止沉淀或离心收集藻体，即得到融合型口服干扰素。...

【技术特征摘要】
1.一种禽用融合型口服干扰素的制备，其特征在于其具体制备步骤如下 1)禽α、Y干扰素基因的制备分别设计两对特异性引物禽α干扰素基因引物序列为上游引物5 ’ TCTAGAATGGCTGGGCCATCAGCCCC3，，下游引物5 ’ GGATCCCGTGTTGGTGCGGGT3’，下划线所指为上下游引物分别引入的油a 和ifeMl 酶切位点；Y干扰素基因基因引物序列为上游引物5’ GGATCCACTTGCACTACCCAGACTTAC3 ,下游引物5’GAGCTCTTACGTGTTGGTGCGGGTGA 3 ’，下划线所指为上下游引物分别引入的BanM 和Sac酶切位点，然后通过PCR的方法分别扩增出禽α干扰素基因和禽Y干扰素基因 ’禽α干扰素基因序列如序列表序列1，禽Y干扰素基因序列如序列表序列2 ； 2)转化盐藻细胞真核表达载体构建通过PCR扩增的禽α、Y干扰素基因片段分别与PMD18-T克隆载体连接，通过各自的双酶切鉴定和测序鉴定后分别切下α、y基因片段，通过T4连接酶先后将二者基因连接到真核表达载体pBI-上；将构建好的重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯书营，王艳鸽，王臣，李光大，李爱芳，祁松楠，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：