利用量子点提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，公开了一种提高丹参毛状根中丹参酮的含量的方法，将CdSe量子点加入丹参毛状根培养基或培养液中，培养12～48小时；所述的CdSe量子点在丹参毛状根培养基或培养液中的含量为50～200μg/L。本发明专利技术是使用量子点作为一种诱导剂刺激丹参毛状根的次生代谢产物的生产，在短时间内显著提高收获毛状根时的有效成分含量。本方法作用稳定，效果明显，同时对毛状根的生长影响小于其他诱导子，可以在实际生产中发挥重要的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，涉及一种利用特定粒径和种类的量子点处理丹参毛状根来提高丹参毛状根中总丹参酮的含量的方法。
技术介绍
丹参始载于《神农本草经》，为我国传统名贵中药材，具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦等功效。丹参主要成分包括脂溶性的二萜醌类化合物(丹参酮类成分)和水溶性的酚酸类化合物，二者均具有较强的药理活性，其中丹参酮类物质具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，因此具有巨大的市场需求。丹参酮的结构复杂导致其化学合成过程繁琐、成本较高且易造成环境污染，因此丹参酮的传统生产都是采用生物提取的方式。但是丹参为多年生草本植物，有生长周期较长，药用活性成分含量低等缺点。巨大的市场需求使得丹参野生资源日益减少，而传统的栽培模式也面临着丹参品质退化严重及品种选育成本过高等诸多弊端，因此如何满足丹参酮的市场需求成为目前研究的执占。毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术，它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生毛状根。毛状根培养相对于细胞培养具有遗传和生物化学方面的稳定性，毛状根可以在不含激素的培养基上快速生长并可以大量积累经济价值较高的次生代谢产物.因此，毛状根被认为是极好的获得植物次生代谢产物的原材料。近年来毛状根培养被认为是获得有用次生代谢产物的重要途径。如何在培养过程中提高毛状根中有用次生代谢产物的积累能力成为人们关注的焦点。1996年，黄炼栋等完成了丹参毛状根再生体系的建立，并在毛状根中检测到了丹参酮类活性物质，但总体上丹参毛状根中丹参酮有效成分依然处在较低的水准，无法应用于实际生产。植物的次生代谢主要用于应对不利的外界环境，因此添加诱导物质是常用的提高植物次生代谢产物的方法，其中重金属离子是一种较常用的诱导剂，可以胁迫丹参毛状根产生更多的丹参酮类物质，但是研究发现，重金属离子如Cd等在提高丹参毛状根中丹参酮含量的同时也对丹参毛状根的生长产生了非常不利的影响。因此我们首先将重金属离子制备成粒径更大的量子点，这种量子点加入到毛状根培养基中后可以更加明显的提高丹参毛状根中丹参酮的含量，同时对毛状根的生长影响很小，是一种在实际生产中更为合适的诱导剂。目前对各种文献和专利进行检索尚未发现有类似的报道。因此，本专利技术是一种实际解决丹参酮药源紧缺性的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。本专利技术将CdSe量子点应用于提高丹参毛状根中丹参酮的含量，可以提高丹参酮总量，或者提高二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮TI和丹参酮II A中的至少一种的含量。本专利技术是通过以下技术方案实现的，一种利用量子点提高毛状根中丹参酮的含量的方法，包括如下步骤将CdSe量子点加入丹参毛状根培养基或培养液中，培养12 48小时，优选的培养时间为24 48小时；所述的CdSe量子点在丹参毛状根培养基或培养液中的含量为50 200 μ g/L,优选为 90 120 μ g/L。优选的,所述CdSe量子点的粒径为I 3nm ;更优选的,CdSe量子点的平均粒径为2nm0 所述CdSe量子点在回流条件下水相合成,具体制备方法包括如下步骤(I)将pH=9 10、含有巯基丙酸的可溶性镉盐溶液除去空气后加入硒氢化钠溶 液；所述的可溶性镉盐优选为氯化镉或硝酸镉；混合后的反应体系中，镉元素、硒元素和巯基丙酸的含量分别为O. 4 O. 5mmol/L、0. 4 O. Smmol /I,和 O. 8 I μ mol/L ；硒氢化钠溶液的制备方法为无氧水中加入液氮去除空气，加入摩尔比为I :2.8 3. I的硒粉和硼氢化钠(优选为I :3)，再加入液氮，O 6°C反应8 12小时；(2) 98 100°C回流搅拌反应8 12小时，再用液氮速冻得到CdSe量子点。所述丹参毛状根的培养方法为(I)丹参叶片外植体预培养后与农杆菌共培养I 3天；优选的，用含有PCAMBIA1304+质粒的发根农杆菌转化丹参叶片外植体；(2)在光照条件下继续2 3周长出毛状根，取毛状根继代培养脱菌继续培养。本专利技术的方法使用特定的种类和粒径的CdSe量子点作为诱导剂来刺激丹参毛状根，使其迅速产生更多的丹参酮，能在短时间内显著提高收获毛状根时的有效成分含量。同时对丹参毛状根的生长抑制小于其他的诱导子，有效地减轻了使用重金属离子时会产生的生长抑制，。该法简单易行，效果明显，为丹参毛状根商业化生产奠定坚实的基础，也为规模化生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用。附图说明图I. CdSe量子点的透射电镜图。图2. CdSe量子点诱导丹参毛状根在不同时间的干重变化情况图。图3. CdSe量子点诱导丹参毛状根在不同时间的丹参酮含量变化图；柱状图从左至右依次为DT-I- 二氢丹参酮；CT-隐丹参酮；T-I-丹参酮I ;ΤΙΙΑ-丹参酮II A ;ΤΤ一总丹参酮；CdSeQDs — CdSe量子点；ControI—空白对照。具体实施例方式下面结合具体实施例详细阐述本专利技术。应理解为这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例I发根农杆菌介导PCAMBIA1304+质粒遗传转化丹参获得丹参毛状根。I. I.外植体的预培养剪取无菌丹参苗叶片(l-3cm)，接种到预培养培养基(1/2MS)上，25°C暗培养2d。1.2.农杆菌与外植体的共培养将上述经预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的I / 2MS悬液中浸泡10分钟(轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触)后，取出浸染后的丹参外植体用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2d。1.3.毛状根的诱导和继代培养将上述的共培养2d的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Cef 500mg / L)中，25°C 16h/8h光照培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。剪下(大约l_3cm)的毛状根，接种于1/2MS+Cef 500mg/L培养基中暗培养3周。转入1/2MS+Cef250mg/L培养基中继代筛选，每2周继代培养一次。经过数次继代后即可完全脱菌。再将良好的丹参毛状根转入无抗生素的B5培养基上继续暗培养20d左右。取一段5cm左右的毛状根放入1/2MS液体培养基中100rpm、25°C黑暗下培养约40天待用。实施例2 CdSe量子点的制备及特征确定(I)前体液硒氢化钠(NaHSe)的制备取无氧水5ml加入试剂瓶内，加入液氮剧烈搅拌赶走空气，将8mg硒粉(O. IOmmol)和11. 4mg硼氢化钠(O. 3mmol)放入瓶中，补加少许液氮，密封容器，在4°C下反应10小时。(2)回流条件下合成CdSe :取CdCl2 20. 83mg (O. IImmoI)放入250ml三颈瓶内，加入无氧水245ml，搅拌助溶后加入27. 19ul MPA(巯基丙酸，O. 21 μ mol)，用IOM和IMNaOH调节PH=9. 5±0. 2，加液氮剧烈搅拌排走空气后加入新制备的NaHSe溶液。磁力搅拌、100°C下回流10小时后取出样品液氮速冻得到CdSe量子点(CdSe QDs)。(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用量子点提高毛状根中丹参酮的含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：将CdSe量子点加入丹参毛状根培养基或培养液中，培养12～48小时；所述的CdSe量子点在丹参毛状根培养基或培养液中的含量为50～200μg/L。

【技术特征摘要】
1.一种利用量子点提高毛状根中丹参酮的含量的方法，其特征在于，包括如下步骤将CdSe量子点加入丹参毛状根培养基或培养液中，培养12 48小时； 所述的CdSe量子点在丹参毛状根培养基或培养液中的含量为50 200 μ g/L。2.权利要求I所述利用量子点提高毛状根中丹参酮的含量的方法，其特征在于，培养时间为24 48小时。3.权利要求I所述利用量子点提高毛状根中丹参酮的含量的方法，其特征在于，所述CdSe量子点的粒径为I 3nm。4.权利要求I所述利用量子点提高毛状根中丹参酮的含量的方法，其特征在于，所述CdSe量子点的平均粒径为2nm。5.权利要求I所述利用量子点提高毛状根中丹参酮的含量的方法，其特征在于，所述丹参毛状根的培养方法为 (1)丹参叶片外植体预培养后与农杆菌共培养I 3天； (2)在光照条件下继续2 3周长出毛状根，取毛状根继代培养脱菌后继续培养。6.权利要求I所述利用量子点提高毛状根中丹参酮的含量的方法，其特征在于，所述CdSe...

【专利技术属性】
技术研发人员：开国银，张昂，谢轶羲，梁发祥，肖建波，余锡宾，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：