在传代细胞系中生产传染性襄病病毒制造技术

本发明专利技术涉及含ＩＢＤＶ抗原的传染性囊炎病毒（ＩＢＤＶ）疫苗，ＩＢＤＶ抗原物来自用ＩＢＤＶ感染的哺乳动物细胞系。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术与利用永久性哺乳动物细胞系增殖感染鸟类的传染性囊病病毒(IBDV)、及IBDV抗原有关。鸟类病毒通常在鸡胚中，靠来自鸡胚的细胞底物，如原代、次代鸡胚成纤维细胞(CEF)，原代鸡肝细胞或鸡肾细胞产生。也可在活体动物器官中产生，如在法氏囊中。此种来源得到的病毒，在世界上被广泛用于制备灭活疫苗和活疫苗。用动物和鸡胚来制备疫苗的主要缺点在于它们的质量不能保证。甚至无特殊病原体的小鸡，也会出忽意料地受到感染，使之不适合于疫苗的生产。偶尔，这类感染在一段时间内检测不到。使用永久性细胞系能为这一问题提供一个理想的解决办法。但是至今尚未得到适合于疫苗生产的小鸡细胞系。大多数鸟类细胞系由淋巴母细胞样细胞组成，它们取自患淋巴样白血病即Marek′s疾病的动物。从正常鸡胚成纤维细胞形成永久性细胞系的尝试，尚未成功。偶尔，由正常胚胎获得了细胞系，但在所有例子中，随后即发现它们都含有了反转录病毒基因组，有些甚至可排出病毒颗粒。现已发现，能在鸡胚成纤维细胞培养物上生长的IBDV株(如D78株和SP株)也可有效地培养于哺乳动物细胞系中。已发现，无需使病毒适应哺乳动物细胞底物。而且发现，在哺乳动物细胞中，产量往往远高于CEF系统。病毒的产量通常用“单位体积中的感染性病毒颗粒”(EID50/ml;TCID50/ml)表示。另一确定病毒产量的方法是确定抗原量。用免疫化学技术，如ELISA法，可将病毒制备物的抗原含量与一标准制备物相比较(此标准物抗原量的单位数已定)。用此两类测定方法进行测定哺乳动物细胞系系统的产量都远高于CEF系统。而且，令人惊呀的是，这一可观的产量是在细胞浓度比常规所用生产抗原的CEF系统为低的情况下得到的。哺乳动物细胞系的最适细胞浓度比用CEF的传统生产方法中的细胞浓度低3～6倍。这一结果表明，对于IBDV，一般说来哺乳动物细胞作底物要比CEF为好。同时发现，以此制备的抗原，作为疫苗至少与由CEF制备的抗原同样有效。根据本专利技术，适合于生产IBDV的哺乳动物细胞系是，例如，Vero细胞、黑猩猩肝细胞、水牛Vervet细胞，以及鼠3T3细胞。可在细胞培养瓶中静置培养和在旋转瓶中培养哺乳动物细胞。其它，通常规模更大的培养系统有，培养非贴附性细胞的搅拌器(发酵器)，培养贴附性细胞的微载体系统，以及可用于培养这两类细胞的中空纤维系统。此外，还有许多其它培养贴附性细胞的培养系统。后一系统的一个共同特点是它们有一很大的可供细胞附着的表面。哺乳动物细胞培养需用复杂的培养液。它们通常由基础液(培养基)和一种或多种添加物组成，基础液在化学上业经明确，而添加物则尚无明确的化学定义。添加物通常为富含蛋白质的溶液，如血清和蛋白水解产物。血清对于细胞生长和分裂确是必不可少的。许多培养系统都加入浓度为1～10%(v/v)的胎牛血清(FoCs)或禁食小牛的血清(FaCS)。只有在特别的情况下，有可能在适应一段时间后，将哺乳动物细胞培养在不含血清，甚至不含蛋白的培养基中。根据本专利技术，IBD病毒如果需要，可于事先减毒后作为活病毒组成疫苗，或者作为灭活病毒成为疫苗。含活病毒的疫苗，可采取悬液或冷冻干燥的形式制备和出售。冷冻干燥的疫苗最好含一种或几种稳定剂。适合的稳定剂有，例如，SPGA(Bovarnik(1950)J.Bacteriology59;509)，碳水化合物(如山梨糖、甘露糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖)，蛋白质(如清蛋白、酪蛋白)和它的降解物、含蛋白质的材料(如牛血清、脱脂奶)及缓冲液(如碱金属磷酸盐)。如果需要，还可加入一种或多种有佐剂作用的化合物。适于这一目的化合物有，例如，氢氧化铝、磷酸盐或氧化物、矿物油(如BayolF，Marcol52)和皂角苷。灭活IBD病毒的目的在于消除病毒的复制和毒性。总的来说，这可通过化学或物理方法实现。可用酶、甲醛、β-丙酸内酯、氮杂环丙烷或其衍生物、有机溶剂(如卤化烃)、和/或去垢剂(如Tween 、Triton X 、脱氧胆酸钠、硫酸甜菜碱或乙酰三甲基胺盐处理病毒，进行化学灭活。如果必要，灭活剂随后可被中和，例如，用甲醛灭活的材料可用硫代磷酸中和。使病毒受高能辐射，如紫外光、X射线、γ-射线，可很好地实现物理灭活。如果需要，可在处理后将PH值调回至7左右。在灭活的病毒材料中，通常要加入佐剂(如上面提到的例子)，如果需要，还要加入一种或几种乳化剂如Tween 和Span 。根据本专利技术，疫苗适合于使家禽(如鸡和火鸡)抵抗IBD(Gumboro′s疾病)的感染。根据本专利技术，可通过肌肉注射、皮下注射、或卵内注射、眼滴、鼻滴、饮水或喷雾方式给予疫苗。根据本专利技术(其它疫苗)与IBDV材料一起组成联合疫苗也包括在本专利技术中。对于灭活疫苗，这一IBDV材料可与新城鸡瘟病毒、感染性支气管炎病毒、卵片综合征病毒、呼肠病毒、细菌(如大肠杆菌)、寄生虫(如艾氏球虫)结合。与新城鸡瘟病毒和/或Marek病毒联合很适合于组成活的联合疫苗。实施例在哺乳动物细胞系上制备IBDV细胞培养细胞材料存于玻璃安瓿里，置液氮中保存。开始细胞培养时，将一安瓿中的材料迅速化冻，并用细胞培养液慢慢稀释。将细胞悬液低速离心，除去冷冻剂中的二甲基亚砜。将沉下的细胞再悬浮于完全细胞培养基中，并将细胞接种于合适的培养瓶。通常，将细胞培养在1∶1的M199/F10混合培养基中，或培养在补充了胰酶处理的磷酸肉汤的MEM培养基中。培养基含2～10%Focs，如果需要，加入抗生素和杀真菌剂。细胞在37℃下静置培养(组织培养瓶)或在旋转瓶(490cm2)中培养。当细胞密度达到形成了一致密的单层时，用胰蛋白酶处理细胞，为继续培养作准备。病毒的生产、收获和灭活溶解冷冻干燥的毒种，或者融化低温冷冻的毒种。用细胞培养液稀释，使其浓度尽可能达到合适的比例。以100～10-4TCID50/细胞的感染复数(M.O.I.)感染细胞。如果需要，可在接种细胞后直接加入毒种。感染细胞可孵育至10天。通常在病毒感染后的2～10天收获病毒。收集培养瓶中的上清液，用福尔马林灭活。为此，向细胞悬液中加入甲醛直至浓度为0.05～0.2%。混合物在20～22℃下孵育1～3天。生产疫苗为作疫苗用，将灭活的IBDV抗原引入油包水乳化剂中(Marcol 52 )。在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上生产IBDVCEF的制备从10～11日龄的、无特殊病原体的孵鸡蛋中，按技术熟练者所熟知的方法制备CEFs。CEFs的培养用与培养传代细胞系相同的培养基培养CEFs。在培养基中加入Focs或Facs，使浓度达5%。用细胞培养液稀释经胰蛋白酶处理后所得的浓缩细胞悬液，使之浓度为0.5～10×10细胞/ml。将细胞悬液转入组织培养瓶或旋转瓶中。细胞在37～39.5℃下培养约24小时后，便形成一致密集单层。生产、收获、灭活病毒用细胞培养液溶解并稀释冷冻干燥的毒种，使体积大到足以分成合适的量以接种细胞。病毒按10～10TCID/细胞的浓度加入。如果需要，可在接种细胞后直接加入毒种。感染细胞孵育48～96小时后从培养瓶中收集上清液，并用0.2%甲醛在室温下灭活24小时。确定IBDV抗原量。借助定量夹心ELISA法确定IBDV抗原。1.用IBDV特异性抗体包被微量滴定板;2.使各孔充满系列稀释的抗原样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
含ＩＢＤＶ抗原物质的传染性囊炎病毒疫苗，其特征在于，这些抗原物来自于用ＩＢＤＶ感染的哺乳动物细胞系。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：皮特凡德马雷尔，皮特吉拉多斯莫伦，
申请(专利权)人：阿克佐公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]