组织血纤维蛋白溶酶原激活剂类似物的制备方法技术

组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）类似物，其基本上失活的单链形式通过４１４至４３３位有区内进行修饰，能被转化为具有活性的双链形式。特别是在该类似物的４１９位（也可任意在４２０位）上的正电荷氨基酸残基被负电荷或无电荷的氨基酸残基取代，以抑制与４８０位上的氨基酸残基的相互作用。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新的组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)类似物、编码该类似物的DNA的构建、含有该类似物的药物组合物以及制备该类似物的方法。灵敏的酶机制控制血液的流动。为了应答损伤，凝血因子通过血浆的血纤维蛋白原转化为不溶性血纤维蛋白使血液迅速凝固。血纤维蛋白溶酶能有步骤地除去已经形成的血纤维蛋白凝固。如果该机理紊乱，则在血管内不适当地形成凝血，使血液的局部流动受到障碍，导致组织机能失常，继而组织坏死，代之以疤痕组织。伤者视其损伤部位，在各种疾病中患上一种病症，包括心肌梗塞，严重的静脉血栓，肺动脉栓塞和中风，所有这些病症都涉及严重的公众健康问题。血液流动受到障碍时并不立即发生组织损伤，而是若干小时以后才会发展到这种程度。因此，迅速恢复对危及部位的供血将使永久性的损坏降到最低程度。一般认为，在几小时内确保重新打开已经闭塞的血管的治疗极为有利，并且有可能显著减少永久丧失劳动力的患者的人数。对这个问题的研究业已促进天然血纤维蛋白溶解酶的形成。人体中主要的血纤维蛋白溶解酶是血纤维蛋白溶酶，它们以血纤维蛋白溶酶原的形式在血液中循环，并由这种酶原通过对Arg(561)和Val(562)之间的单肽键的蛋白水解裂解形成。这种裂解是一种由诸如组织血纤维蛋白溶酶原激化剂(t-PA)的血纤维蛋白溶酶原激活剂的催化作用。血纤维蛋白溶酶原与血纤维蛋白结合，当其转化为血纤维蛋白溶酶时，将血纤维蛋白降解到可溶性片段。但是血纤维蛋白溶酶是一种非专一性蛋白酶，如其在循环血液中形成，则将降解各种血浆蛋白，包括血纤维蛋白原以及凝固因子Ⅴ和Ⅷ。开始时这些反应是由血液中一种血纤维蛋白溶酶的高效抑制剂α2-抗血纤维蛋白溶酶控制，当该抑制剂耗尽时，由血纤维蛋白溶酶诱发的系统作用变得很明显。血纤维蛋白溶酶原和凝血因子的降解和失活血纤维蛋白酶原裂解产物的累积使血液不能凝固，导致严重出血事件。因此，将血纤维蛋白溶酶原进行一般性激活带有危险性，应予避免。纤维蛋白水解治疗的中心问题是获得有效的血纤维蛋白溶酶原的激活，并且把去除血纤维蛋白限制在封闭部位，同时避免系统性血纤维蛋白原溶解血纤维蛋白酶原激活带来的副作用。将一些血纤维蛋白溶酶原激活剂用作血纤维蛋白溶解剂已进行了临床试验。由β-溶血链球菌衍生的一种蛋白质链激酶与血纤维蛋白溶酶原结合，形成的复合体是一种将血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶的活性酶。换言之，链激酶是将血纤维蛋白溶酶原转化为自激活酶。链激酶不与血纤维蛋白血凝块结合，而且链激酶的系统性副作用很显著。此外，由于链激酶是一种细菌蛋自，能诱发显著的免疫反应。有些患者或者由于以前治疗的结果或者因为过去受过链球菌的感染，所以对链激酶具有抗体。这就使决定有效的治疗剂量复杂化。尿激酶是一种天然存在于人尿中的丝氨酸蛋白酶，它是血纤维蛋白溶酶原的有效激活剂。但是尿激酶活性不是决定于与血纤维蛋白的结合，并且也未显示其对体内外血凝块的溶解具有专一性。似乎从链激酶所知的许多系统性副作用却都有表现。尿激酶原是尿激酶的酶原形式，其中尿激酶的两个链由一个肽键联结。该分子基本上没有酶活性，但其所具有的血凝块专一性却可提高到相当于尿激酶。可能这是由于将血纤维蛋白溶酶催化为活性尿激酶主要发生在血凝块上。由于尿激酶原本身对血纤维蛋白的亲和力似乎较低，所以其机理还不清楚。该分子并未显示其任何临床效益。组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)也是一种丝氨酸蛋白酶，在天然环境条件下激活血纤维蛋白溶酶原。这种激活剂因其对血纤维蛋白具有较强的亲和力而不同于链激酶和尿激酶。此外，血纤维蛋白的存在将使血纤维蛋白溶酶原的激活率增至1000倍，表示t-PA、血纤维蛋白溶酶原和血纤维蛋白之间三元激活复合物的形成。t-PA是具有65000道尔顿的糖蛋白，有两种主要形式单链分子和双链分子，其中双链由一个二硫键联结。两个链中，A链表示源于酶的N-末端部分的多肽;B链表示源于酶的C末端部分的多肽。CDNA衍生的氨基酸序列最早已由Pennica等报导(Nature，301，1983，pp.214-221)。A链(重链)含有一个所谓的指纹区、类生长因子区和两个Kringle结构(K1和K2)，B链(轻链)含有丝氨酸蛋白酶活性的活化部位。处理N末端的区别在于是否另外具有三个残基，关于这一点已有报导(Wallenetal.，Eur.J.Biochem.132，1983.pp.681-686)。下面给出这些序列中较长的序列涉及全长t-PA(参阅图5A-D)的编码。单链转化为双链t-PA是通过血纤维蛋白溶酶的催化并存在于氨基酸Arg(278)和Ile(279)之间单肽键的裂解。这个裂解有效地发生在存在着血纤维蛋白溶酶的血纤维蛋白的表面。两种形式的分子均具有酶活性，但双链形式的专一活性略高些。转化为双链形式时激活因子随测定系统而改变。由于能使血纤维蛋白与t-PA结合并由t-PA强烈促进血纤维蛋白溶酶原活化，已经预料，t-PA在溶解血栓治疗中的应用可以消除由血纤维蛋白溶酶原系统激化产生的问题。但是复杂的临床试验证明，获得血栓溶解所需的很高剂量常常导致系统性副作用。因施用大量t-PA而引起的这些副作用估计即使在无血纤维蛋白情况下也与单链形式的显著活性有关。因此需要降低这种活性，同时在血凝块上激活时防止双链t-PA的血纤维蛋白完全溶解的可能性。本专利技术的目的在于提供具有基本上能减少系统性副作用和显著限制溶解对血纤维蛋白沉积的影响这两个特征的血纤维蛋白溶酶原激活剂。如上所述，t-PA属于丝氨酸蛋白酶族系。一般说来，这些酶均可合成并且是由细胞作为无活性单链酶原形式分泌出来。它们只有将蛋白水解限制在特异部位时，才能成为具有活性的酶。以胰凝乳蛋白酶原激活为例，当通过裂解放出Ile(16)的正电荷α-氨基时，与活化部位的Ser(195)相邻的ASP(194)相互作用进行激活。这种盐桥作用仿佛需要建立蛋白水解活性活化部位的固有构象。大多数丝氨酸蛋白酶的激活都可用来表示这种一般模式，而且多数丝氨酸蛋白酶的单链形式都是纯酶原。因此，以单链形式具有显著活性的t-PA则是这条法则的例外。有人建议，单链t-PA的激活构象可以作为另一个盐桥的结果予以建立，这种盐桥包括有严格位置的能够提供正电荷基团的氨基酸残基，甚至在Arg(278)-Ile(279)键仍保持完整的情况下也是如此。这种作用是否包括如Wallen所述的Lys(280)的α-氨基(Wallen，P.，Pohl，G.，Berg-sdorf，W.，Rhanby，M.，Ny，T.，andJornvall，H.(1983)Eur.J.Biochem132，681-686)或还包括另一个残基，有待研究。本专利技术是根据单链t-PA的活性可由419位上赖氨酸残基的α-氨基与480位上天冬氨酸残基的β-羧基之间的盐桥作用产生的认识提出的。根据t-PA分子蛋白酶区的计算机图像模型预测，认为这些赖氨酸和天冬氨酸残基之间盐桥的存在是作为单链t-PA活性的理由所作的试探性建议(A.HeckelandK.M.Hasselbach，J.Computer-AidedMol.Design2，1988，pp.7-14)。但是并未指明，在该部位上通过防止盐桥的形成，可以使单链形式的t-PA失活，同时又基本保持本文档来自技高网...

【技术保护点】
组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）类似物，其基本上失活的单链形式能被转化为具有活性的双链形式，该类似物是在４１４至４１９位或４１９至４２６位或４２６至４３３位的区内进行修饰。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：拉斯克里斯蒂安彼得森，埃斯帕波埃尔，
申请(专利权)人：诺沃诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]