五步蛇毒溶解纤维蛋白（原）NO.4基因及其应用制造技术

一种分离的多核苷酸（Ｎｏ．４基因），它包括以下的其中一组：　　　　（Ａ）、一种具有与以下序列的多核苷酸：　　　　５’－ａｔｇｇａｇａｔｔｇｔｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｃｃａｔｔｃａａｔｇｔａｃａｃｔａａａｔａｃａａｔｇｇｃｇａｔｔｃａｇａｔａａｇａｔａａａａｇ　　　　ｃａｔｇｇｇｔａｔａｔｇａａａｔｇａｔｃａａｃａｃｔａｔａａｇｔｇａｇａｇｔｔａｃａｇａｔａｔｔｔｇｔａｔａｔｃｇａｔａｔａａｔａｇｔｇｔｃｔｇｃ　　ｃｔｔｇｇａａａｔｇｔｇｇｔｃｃｇａｇａａａｇａｔｔｔｇａｔｔａａｔｇｔｇｇａｇａｃａｔｃａｇｃｇｇａａａａｔａｃｔｔｔｇａａａｔｃａｔｔｔｇｇ　　ａｇａａｔｇｇａｇａｇｃｇａａａｇａｔｔｔｇａｔｔｃａｔｃｇｃａｔａａｇｔｃａｔｇａｔａａｔｇｃｔｃａｇｔｔａｃｔｃａｃｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔ　　ｔｃｇａｔｇｇａｃｃａａｃｔａｔａｇｇａｔｔｇｇｃｔｔａｃｇｔｇｇｃｃａｇｃａｔｇｔｇｔｇａｃｃｃａａａｇｃｇｔｔｃｔｇｔａｇｇａｇｔｔｇｔｔ　　ｃａｇｇａｔｃａｔａｇｃｔｃａｇｔａａａｔｃａｔｔｔｇｇｔｔｇｃａａｔｔａｃａｃｔｇｇｃｃｃａｔｇａａｇａａｔｔｔｇｃｔｃａｔａａｔｃｔｇｇｇｃ　　ｇｔｔｃａｔｃａｔｇａｃｇａａｇｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｔｔｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｔｔａｃａｃａｔｇｃａｔｔａｔｇｔｃｔｃｃｔｇｔｇａｔａａａｃｔｃｔｇｇ　　ａｇａｇｔｔａｔｃａａａｔａｔｔｔｃａｇｃｇａｔｔｇｔａｇｔｔａｔａｔｃｃａａｔｇｔｃｇｇｇａｇｔａｔａｔａｔｃｃｇａａｇｇａｇａａｃｃｃａｃｃ　　ｔｔｇｃａｔｔｃｔｃａａｔａａａｃｃｃｔｔｇａｇａａｃａｇａｔａｃｔｇｔｔｔｃａａｃｔｃｃａｇｔｔｔｃｔｇｇａａａｔｇａａｃｔｔｔｔｇｇａｇｇｃｇ　　ｇｇａａａａｇａｔｔａｔｇａｃｔｇａ－３’（６６６ｂｐ）；　　　　（Ｂ）、一种与（Ａ）的多核苷酸至少有８０％同源性的多核苷酸；　　　　（Ｃ）、（Ａ）或（Ｂ）的多核苷酸的片段。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利说明五步蛇毒溶解纤维蛋白(原)No.4基因及其应用 本专利技术涉及基因工程
，具体地说涉及尖吻蝮蛇(五步蛇毒)溶解纤维蛋白(原)No.4基因、含有该基因的载体、利用该载体进行基因工程化的宿主细胞以及将该基因用于制备溶解纤维蛋白(原)的药物，以对抗血栓形成所引起的栓塞性疾病。血管内血栓形成所引起的栓塞性疾病，尤其是心肌梗塞及脑中风，为目前世界上对人类健康危害最大的疾患，其发病率及病死率均居各病之首。在我国，随着大部分传染性疾病被控制、人们生活水平的显著提高、人群寿命的普遍延长和人口结构老龄化的发展，心、脑血管血栓病的发病率在各种疾病中已上升至第一位和第二位，每年发病300万人以上。并且有理由预期，此类疾病的发病率今后仍会进一步增高。目前，栓塞性疾病的治疗主要依靠抗血小板药(如阿斯匹林)、抗凝血药(如肝素)和纤溶酶原激活药。从原理上说，阿斯匹林和肝素均是抑制凝血机制，使血液失凝而起到预防血栓形成及血栓扩大的作用，对已经存在的血栓则无效，不能作为治疗尤其是急救使用。纤溶酶原激活物为目前临床常用的治疗血栓病的药物，包括链激酶、尿激酶和组织型纤溶酶原激活物(tPA)。它们共同的机制是将内源性的无活性纤溶酶原激活为纤溶酶，后者水解血栓中的纤维蛋白而溶栓。因此，这类药物的共同特点是，其溶纤作用是间接的，起效较慢，且作用较弱，尤其对较大的血栓更是如此。而在心、脑血管发生栓塞的情况下，心肌与神经元在血流被切断后，缺氧数分钟即发生死亡。由于其间接溶栓的作用原理，还使得上述三种药物有对血栓选择性差、易引起出血等副作用。此外，链激酶还会发生过敏反应，tPA价格昂贵而限制了其广泛的应用。尤其需要着重指出的是，现在使用的溶栓药，即使联合应用也有约有25％的患者无效。此外约5-30％的患者使用现有的溶栓药后发生“血管再闭塞”。而且此种再闭塞对继续使用溶栓药无效。综上所述，现有的溶栓药不能完全满足临床的使用要求，迫切需要发展效能更高、疗效更加专一迅速的溶栓药物。国外有关蛇毒的研究报道Agkistrodon contortrix蛇毒含有直接作用的纤溶酶，Crotalus atrox(western diamondback rattlesnake)蛇毒也含有纤维蛋白(原)水解酶，但不激活纤溶酶原，在大鼠静脉血栓模型静脉给药，用造影技术显示有溶栓作用。用组织学的方法检查未发现有肾、肝、心、肺组织坏死和出血的反应。在我国临床上使用的蛇毒制品如去纤酶、抗栓酶，其机理如凝血酶一样，是将血浆的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，降低血浆的粘度，以求达到抗栓作用。其疗效与机制根本不能与溶栓药相比拟。我国独有的五步蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中含有直接溶解纤维蛋白的成分，并且具强烈的生物活性。用柱层析方法分离纯化法，从15个组份中得到几种具有溶纤作用的蛋白质。其中组份II(纤溶因子)具有极高应用价值的生物特性(1)直接溶栓用热板法破坏纤溶酶原后，纤溶因子仍能溶解纤维蛋白；(2)作用快速在体外实验中，纤溶因子作用比尿激酶快一倍；(3)效能高纤溶因子的生物活性比尿激酶更强(130μg相当于尿激酶450u)；(4)副作用低尽管未经纯化的五步蛇毒具有明显的出血作用，但纤溶因子在500μg/ml浓度下，亦未见出血反应。上述这些特点，强烈支持来自五步蛇毒中的纤溶因子可能成为新一代的治疗血栓性疾病的药物。但是，自然来源的五步蛇毒，其成分与生物活性都存在着地区性、季节性变异，实际上难于取得稳定的临床疗效；此外，由于粗制品蛇毒中成份复杂，虽经纯化处理，仍难获得真正单一的化学成份，使临床应用隐含某些毒副作用；自然蛇毒产量有限，成本较高，市场占有能力低；其分子结构及结构与活性的关系，用蛋白质技术依然不能阐明。因此，解决上述问题，对真正确立纤溶因子的临床应用的科学基础无疑是必不可少的。酵母不需要特殊的培养基就能迅速生长和大规模发酵；酵母的DNA较简单并且克隆筛选方便；酵母是真菌生物具有较大肠杆菌完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰，如可以糖基化，能形成正确的二硫键等等，已有蛇毒蛋白在酵母表达成功的先例。本课题以五步蛇毒纤溶因子FII的抗体作探针，从五步蛇毒腺cDNA文库中筛选出FII的基因，克隆到酵母表达载体PPIC9K，转化酵母细胞，实现五步蛇毒纤溶因子FII在酵母中的高效表达，用层析法纯化重组五步蛇毒纤溶因子FII并测定其溶解纤维蛋白的活性。本研究获得大量基因工程制备的五步蛇毒纤溶因子FII，为后续1类新药的药效学研究及评价奠定了基础。蛇毒的研究曾经对生物医学的发展起过关键的作用，如从蛇毒中分离DNA内切酶，极大地推动过分子生物学的研究，从银环蛇毒中发现毒素，为神经递质受体的纯化起了决定性的作用。本专利技术用基因工程制备的五步蛇毒纤溶因子FII，与现在临床应用的多种蛇毒生化制剂相比，可以克服生物活性的地区差异和化学不均一性，提高疗效和产量，成为具有巨大市场价值并具有自主知识产权的临床新药。五步蛇毒纤溶因子FII可以直接溶解纤维蛋白，在有效纤溶剂量下未见出血反应。粗制品蛇毒成份复杂，难以纯化为单一成份；蛇毒产量有限，不利于大规模生产，应用基因工程技术表达纤溶因子可解决上述问题。本专利技术从五步蛇粗毒中分离纤溶因子FII；完成纤溶因子FII基因的筛选、克隆；在酵母细胞中表达纤溶因子FII；纯化表达产物并测定纤溶活性。方法采用离子交换层析和凝胶过滤从五步蛇毒中分离天然五步蛇毒纤溶因了FII，用纤维蛋白原、纤维蛋白作底物测定其活性，通过SDS-PAGE观察其在纤维蛋白原的作用位点；制备多克隆抗体、单克隆抗体及五步蛇毒腺cDNA文库，用抗体作探针从文库中筛选纤溶因子FII基因，并用酶切连接等方法将其克隆入酵母表达质粒PPIC9K中；通过转化及筛选得到高表达酵母菌株；用离子交换层析和疏水层析纯化重组五步蛇毒纤溶因子FII，SDS-PAGE检测纯度，纤维蛋白平板法测定其纤溶性；通过SDS-PAGE观察其对IgG和白蛋白的作用；用狗肺血栓模型测定其体内纤溶活性。结果通过三次层析从粗毒中纯化了纤溶因子FII，SDS-PAGE显示为单一条带，分子量为25,500。五步蛇毒纤溶因子FII降解纤维蛋白原的Aα、Bβ链，对γ链几乎没有降解作用；可以剂量依赖地溶解纤维蛋白。成功制备了多克隆抗体、单克隆抗体及五步蛇毒腺cDNA文库，从文库中筛选到一个纤溶因子FII基因，构建了重组质粒PPIC9K-FII。转化酵母细胞后，PCR证实重组质粒被整合到酵母染色体上。以降解纤维蛋白原活性为指标，筛选到一高表达菌株，在表达第3天活性达到高峰。通过两次层析纯化的重组五步蛇毒纤溶因子FII在SDS-PAGE呈单一区带，对纤维蛋白有较强的溶解作用，对IgG和白蛋白无降解作用。对右下肺动脉血栓溶解很好，给药1小时后再通率平均为83.3％。结论在酵母中高效表达了五步蛇毒纤溶因子FII，重组纤溶因子FII有较高的纤溶活性。天然五步蛇毒分离的溶纤活性因子FII，产量较低，质量不稳定。本专利技术用基因工程酵母系统表达的溶纤因子，活性高，产量大，质量稳定，成本低。在整体动物血栓模型，溶栓效果良好，出血反应少。强烈地提示其可成为新型的强效的溶栓药，社会效益和经济效益巨大。附图说明图1五步蛇毒的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：颜光美，陈家树，邱鹏新，单鸿，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：