纤维蛋白溶解剂药用组合物制造技术

本发明专利技术介绍了金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂（纤溶酶（ｆｉｂｒｏｌａｓｅ）或ＮＡＴ）的冷冻组合物和冻干组合物、制备所述冻干组合物的方法以及用于复制所述冻干组合物的药盒和方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纤维蛋白溶解剂的新型药用组合物。更具体地说，本专利技术涉及纤维蛋白溶解酶(fibrolase)及“新型作用血栓溶解剂”(NAT)各自的冷冻液体组合物和冻干组合物以及它们的生产和使用方法。
技术介绍
一般来说，多肽在水溶液中稳定性较差，通常会发生化学降解和物理降解，导致加工和贮存期间生物活性丧失。尤其在水溶液时遇到的另一个问题是水解，如脱氨和肽键断裂。这些问题是根据生物活性给予患者规定剂量的治疗活性多肽存在的严重问题。为减少多肽的降解，通常使水型药用组合物冷藏或冷冻备用。作为替代方法，经常采用冷冻干燥方法稳定多肽以便可以长期贮存，尤其是当所述多肽在液体组合物中相对不稳定时。一个冷冻干燥循环通常包括以下三个步骤冷冻、初次干燥、二次干燥；Williams和Polli，Journal of Parenteral Science and Technology，第38卷，第2期，第48-59页(1984)。在冷冻步骤中，将所述溶液冷却直至充分冷冻。在这一步骤中，溶液中大量水形成冰。冰在初次干燥步骤中升华，该步骤是利用真空将冷冻室内压降至冰蒸发压以下进行的。最后，在第二个干燥步骤中，在室内压降低和存放架温度升高下除去吸附或结合水。这一过程获得称作冻干饼的物质。此后所述冻干饼可在使用前复制。复制冻干物质的标准方法是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干期间除去的水体积)，但是有时复制胃肠外给药药物时使用抗菌剂稀释液；Chen，Drug Development and Industrial Pharmacy，第18卷，第11-12期，第1311-1354页(1992)。冷冻干燥被认为是去除多肽溶液中多余水份的最好方法之一。冷冻干燥工艺可获得稳定且适合长期贮运的产品。冷冻干燥产品可在室温下贮存，因此更易于贮运及分销到更广泛的地理市场，例如可能没有冷藏条件的国外市场。人们已经注意到，某些情况下赋形剂对冻干产品起稳定剂的作用；Carpenter等，Developments in Biological Standardization，第74卷，第225-239页(1991)。例如已知的赋形剂包括多元醇类(包括甘露醇、山梨醇和甘油)；糖类(包括葡萄糖和蔗糖)及氨基酸类(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。此外，多元醇和糖也经常用来保护多肽免受冷冻和干燥引起的破坏并提高在干燥状态下贮存时的稳定性。一般来说，糖类尤其是二糖在冷冻干燥过程和贮存期间均有效。也有报道，其它类型分子包括单糖和二糖及诸如PVP的聚合物用作冻干产品的稳定剂。专利技术概述本专利技术涉及纤溶酶(fibrolase)及“新型作用血栓溶解剂”(NAT)的稳定药用组合物，其中有些是适于在冷冻状态下贮存的液体组合物，而其它适于冷冻干燥贮存。因为纤溶酶和NAT的纤维蛋白溶解特性，本专利技术的组合物可用于体内溶解血凝块，因此可治疗性给药。对于本专利技术目的，术语“NAT”指具有纤维蛋白溶解活性的金属蛋白酶，其特征在于SEQ ID NO1。所述NAT多肽由SEQ ID NO2的cDNA分子编码，但是编码相同多肽的任何DNA分子变异体序列可用于按照下文提及的方法进行表达和生产。纤溶酶是已知的金属蛋白酶，曾经描述于科学文献和专利文献；参见Randolph等，Protein Science，Cambridge University Press(1992)，第590-600页，及1989年7月12日公布的欧洲专利申请第0 323 722号(Valenzuela等)。通常本专利技术组合物中所用的纤溶酶属于SEQ ID NO3，它由SEQ ID NO4的cDNA分子编码(或其编码相同氨基酸序列的变异体)。纤溶酶和NAT不同于其它治疗体内凝血块的治疗药，例如尿激酶、链激酶和tPA，它们是纤溶酶原激活物。与所述药物不同，纤溶酶和NAT直接作用于凝血块而降解纤维蛋白和纤维蛋白原。除治疗有效量纤溶酶或NAT外，本专利技术的药用组合物在药学上可接受的缓冲剂中包含锌稳定剂以及任选增量剂，包含或不含其它赋形剂，它们合在一起提供可长期贮存的稳定冷冻产品或稳定冻干产品。一方面，本专利技术提供包含纤溶酶或NAT、水溶性锌盐、柠檬酸缓冲剂、任选其它选自水溶性钙盐的稳定剂及任选增量剂(如甘露醇)的可冷冻的药用组合物。也可加入表面活性剂如吐温80(BASF，Gurnee，Illinois)以提高冻融稳定性。可加入Tris缓冲剂(Sigma，St.Louis Missouri)或其它缓冲能力高于pH7.0的缓冲剂使pH稳定在7.4或7.4以上。在本专利技术的另一方面，所述药用组合物可以是可冻干的或已冻干的药用组合物，它包含纤溶酶或NAT、锌稳定剂(如水溶性锌盐)和柠檬酸缓冲剂，该组合物含有或不含其它赋形剂(例如增量剂，诸如甘露醇、甘氨酸等)。所述冻干组合物也可以含有作为冻干保护剂的二糖，例如蔗糖或海藻糖。可加入表面活性剂如吐温80保护金属蛋白酶(纤溶酶或NAT)免受冷冻干燥应力。最好使用pKa在8.0±0.5范围内的合适缓冲剂(如Tris)，使pH保持于8.0±0.5。本专利技术还包括制备冻干组合物的方法，该方法包括以下步骤(i)将纤溶酶或NAT与缓冲剂和水溶性锌盐及任何所需的任选成分混合，(ii)冷冻干燥该混合物。另外，本专利技术提供制备药用组合物水溶液的药盒，它包含装有上述冻干组合物的第一个容器及装有其生理学上可接受溶剂的第二个容器。此外，本专利技术的再一方面包括包含以下步骤的方法复制所述冻干组合物；将复制组合物给予需要溶解血凝块的患者。专利技术详述按照本领域技术人员已熟知的标准重组表达方法，可使用各种宿主-载体系统表达纤溶酶或NAT多肽的编码序列，由此获得用于所述组合物的纤维蛋白溶解活性多肽。所述系统包括但不限于真核生物细胞系统如感染病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物如含酵母菌载体的酵母菌；或原核生物细胞系统如用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌(如大肠杆菌)。这些载体的表达元件在其强度和特异性上各不相同。根据所使用的宿主-载体系统，可使用众多合适转录和翻译元件中的任何一种元件。因其效率较高，优选采用酵母表达系统(如巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))进行重组表达，这类系统的详细描述可见美国专利第4,855,231号(Stroman等)、美国专利第4,812,405号(Lair等)、美国专利第4,818,700号(Cregg等)、美国专利第4,885,242号(Cregg)及美国专利第4,837,148号(Cregg)，它们的公开内容通过引用结合到本文中。纤溶酶在所述系统中的表达通常涉及SEQ ID NO5的DNA分子，它编码“成熟”多肽(核苷酸784-1392)之外还编码“前原”序列(核苷酸1-783)。NAT在所述系统中的表达通常涉及SEQ ID NO6的DNA分子，它编码“成熟”多肽(核苷酸784-1386)之外还编码“前原”序列(核苷酸1-783)。关于NAT及其制备方法的进一步细节可见与本申请同时提交的普通转让的共同未决专利申请序号＿＿(代理人参考号A-596)，其通过引用结合到本文中。制备、纯化并分析所述多肽(纤溶酶或NAT)活性(使用本领域技术人员本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药用组合物，它在药学上可接受的缓冲剂中包含选自纤溶酶和新型作用血栓溶解剂（ＮＡＴ）的金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂、锌稳定剂以及任选增量剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：BS肯德里克，B彼得森，
申请(专利权)人：安姆根有限公司，
类型：发明
国别省市：US[]