【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽医传染病快速诊断，特别涉及一种区别鸭3型甲肝病毒(dhav-3)野毒株和弱毒疫苗株的pcr-rflp方法及其试剂盒。
技术介绍
1、鸭3型甲肝病毒(duck hepatitis a virus type 3，dhav-3)为小rna病毒科禽肝病毒属的成员。该病主要侵害3周龄内的不同品种的雏鸭，发病率和病死率可达100％，该病给养鸭业造成巨大的经济损失。
2、鸭甲肝病毒的核酸为单股正链rna以高度浓缩状态位于成熟病毒颗粒中，其基因组长度为7.1kb至8.9kb，仅含有单个开放阅读框(orf)，以及两侧的5'和3'非翻译区(5'-utr和3'-utr)。该orf编码一个假定多聚蛋白，该多聚蛋白又被分为1个结构蛋白复合体p1，两个非结构蛋白复合体p2和p3。三个区域在病毒编码的蛋白水解酶作用下，p1复合体可依次被水解为vp0、vp3和vp1三种衣壳蛋白，p2和p3复合体主要水解成8～9种非结构蛋白，包括：2a1、2a2、2a3、2b、2c、3a、3b、3c和3d等。预测推测其基因组结构具体为5'utr-vp0-vp3-vp1-2a1/2a2/2a3-2b-2c-3a-3b-3c-3d-3'utr-poly(a)。
3、目前国内对鸭肝炎的预防主要依靠弱毒疫苗，《鸭病毒性肝炎活疫苗(3型，hb80株)》为我国最早获得的针对鸭3型甲肝病毒活疫苗的二类新兽药注册证书，这将有望最早成为我国商品化的鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗毒株(hb80株)。存在的问题是：首先蛋鸭在免疫之后的7天左右才产生良好的细胞免疫和体液
4、目前在genbank里录入的我国分离的鸭3型甲肝病毒野毒株(我国录入的毒株)在2a基因中均存在核苷酸gggccc(apai酶切位点)，而疫苗弱毒株(hb80株)在相对应位置的核苷酸为gggtcc。同时rflp(restriction fragment length polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)是近年来以基因位点差异而引起内切酶位点不同的一种分子生物学标记技术，已广泛应用于真核细胞基因组种群内、种群间(基因差异往往很小)的分型研究工作中，应用rflp技术可对dna链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点进行分析。因此，我们设计1组引物并结合鸭3型甲肝病毒野毒株和鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株的核苷酸特征，利用快速apa i限制性内切酶进行rflp酶切分析对鸭3型甲肝病毒野毒株和鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株进行鉴别诊断。本专利技术检测方法快捷准确，该pcr-rflp方法可填补国内外相关领域研究空白。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的pcr-rflp方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的pcr-rflp引物，序列为：
4、dhav3-f：5’-acacccacgctgttgaatga-3’，
5、dhav3-r：5’-acttggcggtggcaatctta-3’。
6、上述一种pcr-rflp引物在制备区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的试剂盒中的应用。
7、一种区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的试剂盒，包括2×one-stepreaction mix、trans scriptⅱone-step enzyme mix、灭菌去离子以及上述的pcr-rflp引物。
8、一种非疾病诊断目的的区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的pcr-rflp方法，如下：
9、1)rt-pcr扩增反应体系为：提取的病毒rna模板3μl、10μm的引物dhav3-f 1μl、10μm的引物dhav3-r 1μl、2×one-step reaction mix 15μl、trans scriptⅱone-stepenzyme mix 1μl，灭菌去离子水9μl；rt-pcr扩增反应条件为：50℃反转录30min后进行pcr扩增，条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸55s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存备用；
10、2)rt-pcr产物经胶回收后，利用rflp进行apai酶切分析；酶切反应体系为：rt-pcr胶回收产物6μl、10×quickcut buffer 3μl、quickcuttmapa i酶1μl、灭菌去离子水20μl；酶切反应条件为：37℃水浴反应5min。
11、本专利技术的显著优点在于：
12、本专利技术的方法仅需上游引物dhav3-f和下游引物dhav3-r，并仅需常规限制性内切酶apa i进行rflp酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程，本专利技术在鸭3型甲肝病毒野毒株和鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株快速鉴别诊断检测上快捷准确，解决目前尚未能解决的区别弱毒疫苗株与野毒株的难题，可以对免疫我国获得新兽药注册证书的活疫苗株(hb80株)进行鸭3型甲肝病毒检测与该病的诊断以及实验研究中这些病毒株的相互鉴别。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP引物，其特征在于：所述的
2.如权利要求1所述的PCR-RFLP引物在制备区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的试剂盒中的应用。
3.一种区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括2×One-Step Reaction Mix、Trans ScriptⅡ One-Step Enzyme Mix、灭菌去离子以及权利要求1所述的PCR-RFLP引物。
4.一种非疾病诊断目的的区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述的PCR-RFLP方法如下：
【技术特征摘要】
1.一种区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的pcr-rflp引物，其特征在于：所述的
2.如权利要求1所述的pcr-rflp引物在制备区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的试剂盒中的应用。
3.一种区别鸭3型甲肝病毒弱毒疫苗株和野毒株的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括2×o...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅秋玲，黄瑜，万春和，傅光华，施少华，程龙飞，陈红梅，刘荣昌，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。